滑膜组织Bcl-2/Bax表达：Bcl-2蛋白家族是参与细胞凋亡的关键调节因子，在Bcl-2蛋白家族中Bcl-2是起主要作用的抗凋亡蛋白，Bax是重要的促凋亡蛋白，Bcl-2/Bax是启动细胞凋亡的“分子开关”，滑膜组织中Bcl-2/Bax比值的增高促进了类风湿关节炎的发生发展。

类风湿关节炎是一种以关节滑膜增生、慢性炎症为最主要病理表现的自身免疫性疾病[1]，目前在国内外仍属难治之症。近年来，作者导师运用针刀治疗类风湿关节炎取得了较好的临床疗效，且在研究中发现，针刀治疗通过调节类风湿关节炎患者关节滑液中肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和白细胞介素10炎症细胞因子的水平，减轻了关节炎症反应；通过调节与类风湿关节炎发病密切相关的关节滑液基质金属蛋白酶的表达，有效调控了关节软骨细胞外基质的降解；且针刀治疗后类风湿关节炎患者血清中类风湿因子、C-反应蛋白、血沉含量降低，针刀治疗通过活化血清中自由基清除剂超氧化物歧化酶，有效清除多余自由基，从而在一定程度上保护受损的滑膜及骨组织[2,3]。随着针刀治疗类风湿关节炎的临床观察日益增多[4,5]，其疗效也逐渐受到认可，但其具体作用机制却未见实验研究报道。

有研究表明，类风湿关节炎的关节病理表现与滑膜成纤维细胞的凋亡密切相关[6]。由于滑膜组织中凋亡调节因子Bax、Bcl-2表达水平的变化对类风湿关节炎的发生发展具有重要意义[7]，实验通过观察针刀治疗对胶原诱导性关节炎(collagen-inducedarthritis,CIA)大鼠滑膜组织中Bax、Bcl-2表达的影响，探究针刀治疗类风湿关节炎的作用机制。

1、材料和方法

1.1 设计

随机对照动物实验，盲法评估。

1.2 时间及地点

实验于2018年8月至2019年5月在湖北中医药大学针灸研究所实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物

SPF级SD大鼠40只，雌性，体质量180-200g，动物合格证号SCXK(鄂)2017-0012，由湖北省实验动物中心提供。饲养条件：温度20-25℃，湿度45%-55%，自由取食和饮水。实验过程中对大鼠的处置符合中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.3.2 针刀和试剂

一次性汉章系列无菌针刀(0.4mm×30mm)由北京健力园医疗器械有限公司生产，牛Ⅱ型胶原蛋白粉末(CII，批号：C8000)、弗氏不完全佐剂(IFA，批号：F5506)购自Sigma公司，磷酸盐缓冲液(PBS，批号：PN0001)由武汉市皮诺飞生物科技有限公司生产，TRIzolReagent(Ambion15596-026)、cDNA合成试剂盒、PowerUpTMSYBR®GreenMasterMix(批号：00684043)由美国ThermoScientific公司生产。Bcl-2一抗(批号：Ab32503)、Bax一抗(批号ab32503)购自Abcam公司；488标记HRP山羊抗兔(批号：074-1506)购自KPL公司，CY3山羊抗兔(批号：111-165-003)购自Jackson公司，DAPI(批号：C0060)、抗荧光淬灭封片剂(批号：S2100)购自Solarbio公司。

1.3.3 主要仪器

TGL-10B系列台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，石蜡切片机(型号RM2245，德国莱卡公司)，包埋机(型号KD-BM，浙江金华科迪有限公司)，成像系统(型号NikonDS-U3，日本尼康公司)，Aquaplus2系列艾科浦超纯水制成机(美国艾科浦国际有限公司)，C16000型全自动生化仪(美国雅培公司)，Bio-RadCFX96型荧光定量PCR仪(美国伯乐公司)，倒置显微镜(日本Olympus公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 分组及处理

适应性饲养1周后将大鼠编号，随机抽出10只作为正常对照组，对其余30只大鼠建立胶原诱导性关节炎模型。初次免疫后第14天评估造模效果，在造模成功的大鼠中随机选取20只，并随机分为模型对照组和针刀治疗组各10只。正常组和模型组大鼠正常饲养，不予任何处理；对针刀组大鼠进行针刀松解，操作步骤如下：使用自制鼠衣将大鼠固定在治疗台上，在大鼠左侧患膝进行触诊，触及膝关节周围相应软组织：第1次治疗选取髌内、外支持带，第2次治疗选取膝内、外侧副韧带，第3次治疗选取髌底上缘中点和髌韧带的中点作为进针刀部位，用龙胆紫标记，常规备皮、消毒后，按4步进针规程刺入针刀，于深度约0.2cm处行纵向疏通法，再辅以横行剥离手法操作3刀，随即出针，用无菌干棉球按压3min止血。每7d治疗1次，共治疗3次。

1.4.2 模型制备与评价

参照GU等[8]的方法制备胶原诱导性关节炎模型：将冻干的牛Ⅱ型胶原蛋白溶解于0.1mol/L乙酸溶液中，质量浓度为400mg/L，置于4℃冰箱过夜，再将等体积的牛Ⅱ型胶原蛋白溶液和弗氏不完全佐剂混合并充分乳化，制成Ⅱ型乳剂(每100μL含20μgⅡ型胶原蛋白)，置于4℃冰箱保存备用。在尾根部皮内注射100μLⅡ型乳剂免疫大鼠；在第7天给予20μgⅡ型乳剂加强注射。正常对照组用生理盐水同法注射。观察大鼠的一般情况，于初次免疫前(第0天)及初次免疫后第7,14,21,28,35天分别测量各组大鼠体质量、左后足趾厚度，并记录大鼠关节炎指数(arthritsindex,AI)评分，具体评分标准如下：无关节红肿记0分，趾关节红肿记1分，趾关节和足跖肿胀记2分，踝关节以下的足爪肿胀记3分，踝关节在内的全部足爪肿胀记4分。每个关节最高分为4分，4个关节累计积分即为每只大鼠的关节炎指数评分，关节炎指数评分≥4表示造模成功。

实验动物造模过程的相关问题

1.4.3 苏木精-伊红染色观察关节滑膜的形态学变化

初次免疫后35d，各组随机选取5只大鼠，在戊巴比妥钠麻醉下纵行切开大鼠致炎侧(左足)膝部皮肤，隔离中央肌肉，暴露膝关节，剥离支持组织。用PBS洗去血迹和残渣，在40g/L多聚甲醛中固定1周后将组织转移至20-30倍体积的EDTA脱钙液中6-8周，用大头针探刺关节脱钙满意后，置于常规梯度乙醇中脱水，二甲苯透明后进行石蜡包埋，5μm厚连续切片。用苏木精和伊红染色后在400倍光镜下观察关节滑膜病理形态。

1.4.4 实时定量PCR法检测滑膜组织Bcl-2、BaxmRNA表达

各组所剩另5只大鼠在戊巴比妥钠麻醉下用手术刀轻轻刮取左膝关节滑膜组织用于PCR指标检测。切取冰冻滑膜组织50-100mg，在研钵中加液氮充分研磨，用Trizol法提取滑膜组织总RNA,按cDNA合成试剂盒说明书操作,将RNA反转录为cDNA，运用SYBRGreenI染料法，在Bio-RadCFX96型荧光定量PCR仪上,进行各目的基因的定量检测。PCR引物序列(见表1)由昆泰锐(武汉公司)合成，以β-actin作为内参对照，反应总体系为20μL，反应扩增条件：50℃2min,95℃2min,95℃15s、60℃15s、72℃1min，共40个循环。反应结束获得Bax、Bcl-2的循环阈值(cyclethreshold,Ct)，根据采用2-ΔΔCt公式计算目的基因的相对表达量。

表1|RT-PCR引物序列

1.4.5 免疫荧光技术检测滑膜组织Bcl-2/Bax表达

依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-体积分数85%乙醇5min-75%乙醇5min-蒸馏水洗。然后组织切片置于盛满EDTA抗原修复缓冲液(pH8.0)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复。用组化笔在组织周围画圈，在圈内滴加BSA孵育30min，在切片上滴加PBS按一定比例配好的Bcl-2一抗(1∶150),4℃孵育过夜；玻片置于PBS(pH7.4)中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗(1∶500)覆盖组织，室温孵育50min。PBS漂洗5min×3次加Bax一抗(1∶250)，加二抗CY3山羊抗兔(1∶300):PBS漂洗5min×3次后滴加CY3山羊抗兔，避光室温孵育50min。DAPI复染细胞核避光室温孵育10min。PBS洗3次，滴加抗荧光淬灭封片剂封固。切片于荧光显微镜下观察并采集图像。

1.5 主要观察指标

(1)大鼠一般情况及体质量；(2)大鼠左后足趾厚度及关节炎指数评分；(3)大鼠关节滑膜病理形态学观察；(4)PCR检测结果；(5)免疫荧光检测结果。

1.6 统计学分析

使用SPSS25.0进行统计分析，计量资料若呈非正态分布、方差不齐者采用两样本非参数的秩和检验；符合正态分布和方差齐性，用x-±s表示，组间比较采用单因素方差分析方法、t检验，P<0.05为差异有显著性意义，P<0.01为差异有非常显著性意义。

2、结果

2.1 实验动物数量分析

40只大鼠中正常对照组10只，剩余30只进行了胶原诱导性关节炎造模，其中21只关节炎指数评分≥4，提示造模成功，成模率为70%，与王琦[9]的研究相符。造模成功的21只大鼠中随机选取20只进行后续实验。纳入实验的30只大鼠实验过程中无感染或死亡，均进入结果分析。大鼠造模分组流程见图1。

图1|大鼠造模分组流程图

2.2 大鼠一般情况及体质量

造模大鼠在试验期间精神逐渐处于激惹状态，摄食及活动减少，体质量增长缓慢，行动不灵活甚至跛行，毛发变得黯淡枯燥，足趾渐渐红肿，发病部位主要分布在后足，前爪受累仅在实验后期发生。与正常对照组相比，模型对照组体质量明显减轻(P<0.01)；与模型对照组相比，针刀治疗组体质量有所增加，差异有显著性意义(P<0.05)。针刀治疗后胶原诱导性关节炎大鼠反应更灵敏，活动更灵活，足趾肿胀程度逐渐减轻。见图2,3。

2.3 大鼠左后足趾厚度及关节炎指数评分

正常对照组关节无一发病。造模成功后，与正常对照组比较，模型对照组左后足趾厚度及关节炎指数评分增加明显(P<0.01,P<0.01)；与模型对照组比较，针刀治疗组左后足趾厚度及关节炎指数评分减小(P<0.05,P<0.05)。见图4,5。

2.4 大鼠关节滑膜病理形态学观察

正常对照组滑膜细胞一两层，滑膜内层细胞未见炎细胞浸润，滑膜下层未见颗粒细胞增生、血管化及炎细胞浸润；模型对照组滑膜细胞层数明显增厚，排列紊乱，滑膜可见大量炎性细胞浸润；针刀治疗组滑膜细胞层数增加，但炎症细胞浸润较少，见图6。这表明针刀治疗减轻了胶原诱导性关节炎关节滑膜炎症反应。

2.5 PCR检测结果

造模后及针刀治疗后，滑膜组织BaxmRNA表达未见明显变化，各组间比较差异无显著性意义(P>0.05)。与正常对照组比较，模型对照组大鼠滑膜组织Bcl-2mRNA表达显著上调(P<0.01)；与模型对照组比较，针刀治疗组大鼠滑膜组织Bcl-2mRNA表达显著下调(P<0.01)。与正常对照组比较，模型对照组大鼠滑膜组织Bcl-2/BaxmRNA表达显著上调(P<0.01)；与模型对照组比较，针刀治疗组大鼠滑膜组织Bcl-2/BaxmRNA表达显著下调(P<0.01)。见图7。

2.6 免疫荧光检测结果

与正常对照组比较，模型对照组大鼠滑膜组织Bcl-2/Bax荧光强度显著增加(P<0.01)。与模型对照组比较，针刀治疗组大鼠滑膜组织Bcl-2/Bax荧光强度显著降低(P<0.01)。见图8。

3、讨论

类风湿关节炎是临床常见的慢性自身免疫性疾病，主要侵犯关节滑膜，以滑膜的慢性增生性炎症、血管翳形成、关节软骨及骨损害为主要病理过程，早期即出现滑膜炎[10,11]。滑膜组织在炎症因子的刺激下会导致滑膜细胞凋亡抑制、增生异常，而异常增生的滑膜又不断破坏软骨等组织导致关节炎症加重，形成恶性循环。因此，抑制滑膜组织的异常增生对缓解关节炎具有重要意义，成为了治疗类风湿关节炎的重要目标[12,13,14]。存在于滑膜衬里层的滑膜成纤维细胞是滑膜组织的主要组成部分。滑膜成纤维细胞的大量增生在类风湿关节炎的病理机制中起着关键作用[15]，其过度增殖由凋亡相对不足所导致[16]，因而，诱导滑膜成纤维细胞的凋亡是抑制滑膜增生的重要途径[17]。

研究表明，Bcl-2家族对线粒体膜通透性的调节、NF-KappaB信号通路的激活、p53突变等多种途径皆与类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的凋亡有关[18,19]，其中与线粒体反应相关的研究广泛。在线粒体途径上Bcl-2蛋白家族作为参与细胞凋亡的核心家族，对凋亡的调控意义尤为突出[20,21,22]。在Bcl-2蛋白家族中Bcl-2是起主要作用的抗凋亡蛋白，Bax是重要的促凋亡蛋白，二者动态变化可引起线粒体膜通透性改变，从而激活线粒体凋亡通路[23,24]。Bcl-2过多将阻止其与Bax之间形成同源二聚体，而Bax同源二聚体的相对减少，使细胞免受凋亡[25]。在类风湿关节炎的发病过程中，Bcl-2呈明显高表达状态，而Bax表达水平升高的幅度远远低于Bcl-2升高的水平，使Bcl-2/Bax比值升高，从而造成滑膜细胞增殖/凋亡失衡，促进了类风湿关节炎的发生发展[7,26]。通过调节Bcl-2/Bax比值来发挥对滑膜成纤维细胞的促凋亡作用，从而抑制滑膜细胞增殖，可有效治疗类风湿关节炎[27]。

针刀疗法是一种融合了中医针刺疗法和西医手术疗法之优点的新疗法[28]。临床研究证实，针刀治疗类风湿关节炎疗效突出，具有抗炎镇痛作用，能有效改善类风湿关节炎患者的疼痛、肿胀和功能障碍[29]。在类风湿关节炎发病过程中，关节内炎性反应不断加重，渗出液不断增加，致使关节内承受了巨大的张力，进而导致关节变形甚至功能丧失；针刀治疗可以通过“针”的刺激和“刀”的切割，缓解关节周围软组织痉挛，松解软组织的粘连瘢痕，从而恢复关节局部力学的动态平衡，达到改善类风湿关节炎关节功能活动的目的[30]。有研究证实，针刀治疗可以减轻滑膜囊压力，促进滑囊血液循环，改善滑膜的通透性，以修复损伤的滑膜[31]。然而其修复类风湿关节炎滑膜损伤的分子生物学机制尚未见报道。胶原诱导性关节炎模型是研究类风湿关节炎最理想的动物模型[32]，此次实验旨在从针刀治疗对胶原诱导性关节炎大鼠滑膜组织凋亡因子影响的角度来探究其作用机制。

图2|各组大鼠左后足趾肿胀情况大体照片

图3|各组大鼠体质量变化测量图(x-±s,n=10)

图4|各组大鼠左后足趾厚度变化测量图(x-±s,n=10)

图5|各组大鼠平均关节炎指数评分(x-±s,n=10)

此次研究观察到，在胶原诱导性关节炎大鼠模型中，初次免疫后14d，各组大鼠足趾明显红肿，并出现功能障碍。针刀治疗前，胶原诱导性关节炎大鼠体质量显著降低，足趾肿胀明显；针刀治疗后，胶原诱导性关节炎大鼠体质量有所增加，足趾肿胀程度减轻，关节炎指数评分下降，提示针刀治疗在一定程度上改善了大鼠的健康状况，并发挥了减轻足趾肿胀、减轻局部组织炎症反应的作用。苏木精-伊红染色病理观察显示，针刀治疗组较模型组滑膜层数减少，炎症细胞数量减少，进一步说明针刀治疗可以减轻胶原诱导性关节炎大鼠的滑膜增生程度及关节炎症状况，从而对胶原诱导性关节炎大鼠具有较好的治疗作用。RT-PCR检测结果表明，针刀治疗降低了滑膜组织Bcl-2mRNA的表达，下调了Bcl-2/BaxmRNA比值；免疫荧光染色检测结果也一致性地反映了针刀治疗下调了滑膜组织Bcl-2/Bax的比值。但由于实验尚未检测滑膜细胞凋亡情况，故其是否通过Bcl-2/Bax途径调节了类风湿关节炎滑膜细胞的凋亡有待于进一步细胞实验验证；其调节胶原诱导性关节炎大鼠滑膜组织Bcl-2/Bax表达的具体途径，也有待深入研究。

图6|各组大鼠关节滑膜病理形态学观察(箭头所指处为滑膜层边缘，苏木精-伊红染色，×400)

图7|各组大鼠滑膜组织Bcl-2、Bax、Bcl-2/BaxmRNA表达水平比较(±s,n=10)

图8|各组大鼠滑膜组织Bcl-2/Bax表达的比较

综上所述，实验通过大体水平和基因、蛋白表达水平检测滑膜组织中较为典型的凋亡因子，初步探究了针刀治疗类风湿关节炎的作用机制：针刀治疗能有效降低胶原诱导性关节炎大鼠滑膜组织Bcl-2表达，下调Bcl-2/Bax的比值，这可能是其减轻类风湿关节炎滑膜炎症反应和滑膜增生的作用机制之一。

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基金:湖北中医药大学研究生创新能力提升项目(1010040103).