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桂枝风湿方抑制NF-κB表达治疗类风湿性关节炎机制研究

2021-09-04 235 上传者：管理员

摘要：研究桂枝风湿方对类风湿性关节炎模型大鼠NF-κB表达的影响,探讨该方的功效机制。方法:使用凝胶注射法制备类风湿性关节炎大鼠模型,连续给予不同剂量的桂枝风湿方汤剂,测定其NF-κB表达水平,并与模型对照组比较,验证桂枝风湿方是否通过调控NF-κB表达治疗类风湿性关节炎;然后根据文献报道,选取方中多个化学成分,观察其对LPS诱导的RAW264.7细胞NF-κB转录活性及NO生成的抑制能力,找到桂枝风湿方治疗功效的主要成分。结果:与模型对照组比较,桂枝风湿方能够显著调控NF-κB表达,这可能是该方治疗类风湿性关节炎的主要机制;活性成分筛选结果表明,桂皮醛、白术内酯Ⅰ和藁本内酯具有明显的NF-κB抑制活性,是桂枝风湿方产生治疗作用的物质基础。结论:桂枝风湿方通过抑制NF-κB表达治疗类风湿性关节炎,其功效的主要活性成分为桂皮醛、白术内酯Ⅰ和藁本内酯。

关键词：
NF-κB
作用机制
动物实验
大鼠
桂枝风湿方
类风湿性关节炎
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桂枝风湿方由桂枝、黑顺片、白术、当归等药味组成，为我院治疗类风湿性关节炎或辅助恢复、改善症状用药，具有活血顺气、温阳除湿的功效，临床应用效果较好。同时，由于类风湿性关节炎患者身体状况、疾病情况和疼痛耐受度等存在明显区别，根据中医经典理论，应在诊断的基础上适当调节处方各药味的用量，以达到个性化治疗的效果[1,2,3]。因此，有必要对桂枝风湿方的作用机制进行研究。

中药特别是复方中药的机制和成分较为复杂，单纯从整体层面进行有效性研究无法深入了解其功效主治的生物学内涵[4,5]。因此，应当以与疾病相关的特定信号通路或靶标为切入点，研究中药对该靶标表达的影响及主要活性成分。NF-κB为调控机体炎症反应的核受体，其表达水平与类风湿性关节炎的发生发展密切相关[6,7,8]。本研究拟以该靶标为切入点，明确桂枝风湿方对NF-κB的调控活性并对方中化学成分进行筛选，通过上述实验，可明确桂枝风湿方的作用机制和主要药效物质。

1、仪器与材料

1.1仪器

AVarioskan Flash多功能酶标仪（美国Thermo-Fisher公司）；5424型小型高速离心机（德国Eppendorf公司）；PowerPac Basic电泳仪、Miniprotean Teral Cell垂直电泳槽、制胶器（美国Biorad公司）；371型CO2培养箱（美国Thermo-Fisher公司）；Metteler-Toledo电子分析天平（瑞士MettelerToledo公司）。

1.2材料和试剂

SD大鼠购自广东省实验动物中心（许可证号：SCXK（粤）2018-0002);RAW264.7小鼠巨噬细胞购自中国科学院上海细胞库；NF-κB p65抗体购自英国Abcam公司；iNOS引物购自美国in‐vitrogen公司；裂解液、培养基、蛋白Maker、ECL发光检测试剂盒、BCA试剂盒，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit、MaximaTM SYBRGreen/Fluorescein qPCR MasterMix(2×）、PageRul‐erTM Prestained Protein Ladder、SuperSignal West Pi‐coChemiluminescent Substrate发光液均购自美国Thermo-Fisher公司；1.0M Tris-HCl(pH 6.8）、1.5 MTris-HCl(pH 8.8）均购自美国Bio-Rad公司。桂皮醛（批号：110710-202022）、肉桂酸（批号：110786-201604）、白术内酯I（批号：111975-201501）、白术内酯Ⅱ（批号：111976-201501）、阿魏酸（批号：110773-201915）、藁本内酯（批号：111737-201910）、乌头双酯型生物碱对照提取物（批号：112029-201601）等对照品购自中国食品药品检定研究院。制备桂枝风湿方用药材购自广东康美药业股份有限公司。

2、方法与结果

2.1桂枝风湿方标准汤剂制备

取处方量药材，加水煎煮两次，每次60min，煎液滤过，滤液合并浓缩至≤200mL，转移至250mL量瓶中，加水稀释并定容至刻度，即得。

2.2动物实验

参考文献方法[9]，取SD大鼠分为空白组、模型对照组、低剂量给药组、中剂量给药组和高剂量给药组各3只，除空白组不做任何处理外，其余各组注射Ⅱ型胶原乳剂，每3日测量各实验动物左后足跖厚度，并计算足跖肿胀度，持续18天。以足跖肿胀度明显高于空白组（P<0.05）为造模成功，模型对照组和空白组直接处死，取膝关节备用；各剂量给药组分别给予不同体积的桂枝风湿方标准汤剂（剂量相当于临床用量的50%、100%、200%），持续给予30天，结束后处死动物，取膝关节备用。

2.3桂枝风湿方NF-κB调控活性

取“2.2”项下各组动物膝关节样品，液氮下加入裂解液研磨，提取蛋白，转移至SDS凝胶槽中，加入缓冲液，电转至PVDF膜上，取出，加抗体孵育，显影并使用酶标仪测定荧光值。所得结果导入SPSS 20.0软件中，计算模型对照组与空白组、模型对照组与各给药组的差异。由图1可知，模型对照组NF-κB表达值显著高于空白组（P<0.05），各给药组NF-κB表达值显著高于模型对照组（P<0.05）。上述结果表明，类风湿性关节炎发生的条件下，机体NF-κB表达值显著升高，且桂枝风湿方能够显著抑制该靶标的表达。

2.4方中各成分NF-κB调控活性

使用RAW264.7细胞，以NF-κB质粒进行转染，所得细胞液转移至96孔板中，加入LPS溶液后，精密加入各成分单体溶液（25μM DMSO溶液，每个化合物6孔），孵育过夜，移除培养基，加入裂解液后，置于荧光酶标仪上测定荧光值，比较各组与空白对照组的差异。结果显示（图2），桂皮醛、白术内酯I和藁本内酯具有明显的NF-κB抑制活性，提示这些成分可能是桂枝风湿方产生治疗作用的物质基础。

3、讨论

药效学试验结果表明，桂枝风湿方通过抑制NF-κB表达实现治疗类风湿性关节炎或缓解其症状的功效，且上述结果与剂量呈明显的相关性，因此可以认为NF-κB调控活性是研究该方治疗类风湿性关节炎机制的重要切入点。网络药理学研究结果表明，该靶标在类风湿性关节炎发生和药物治疗条件下表达出现明显变化，与类风湿性关节炎相关的多个炎症因子或体内生理指标如白介素（IL）系列及肿瘤坏死因子（TNF）等相关[10,11]。相比NF-κB，上述因子测定相对简便，且血液中变化规律与相关病变部位基本相同，在后续研究中具有较好的前景。

活性成分筛选结果表明，桂枝风湿方中具有NF-κB调控活性的成分，主要来自桂枝、白术、当归等药味，表明上述成分具有较好的抗炎活性，抑制NF-κB表达可以减少相关炎症因子的释放，进而改善类风湿性关节炎症状。诚然，上述成分在全方汤剂中的含量尚未进行准确测定，故需以这些成分为指标建立含量同时测定方法，以进一步明确活性成分。

参考文献:

[1]陈朴阳,刘涛,范凯健.类风湿性关节炎的生物标志物及其测定[J].医学信息,2020,33(15):37-39,43.

[2]金文渊.,刘育辰张安英,等.抗类风湿关节炎天然产物研究进展[J].中成药,2020,42(7):1851-1857.

[3]王静,赵庆杰,卓小斌;等.类风湿性关节炎的治疗药物研究进展[J].药学实践杂志,2019,37(6):485-490.

文章来源:程莲莲,刘奕烽.桂枝风湿方抑制NF-κB表达治疗类风湿性关节炎机制研究[J].按摩与康复医学,2021,12(18):87-88+91.