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十味乳香胶囊对类风湿性关节炎大鼠的治疗作用

2024-06-19 144 上传者：管理员

摘要：目的探讨藏药十味乳香胶囊对类风湿性关节炎(RA)大鼠的治疗作用。方法建立胶原诱导的RA大鼠病证结合模型并给予相应药物，观察大鼠的一般状态，测量体重、足跖厚度和踝关节肿胀度。给药28 d后，处死大鼠并收集血液、关节、胸腺和脾组织，用于生化和病理检测。结果十味乳香胶囊可抑制血清和滑膜组织中白细胞介素-6、白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α的含量，降低CD4+/CD8+T细胞的比例，改善RA大鼠的关节炎症状。结论十味乳香胶囊对RA大鼠具有较好的治疗效果。

关键词：
免疫
十味乳香胶囊
抗炎
滑膜
病证结合模型
类风湿性关节炎
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类风湿性关节炎(RA)是一种常见的慢性自身免疫性疾病，其临床特征主要是关节滑膜炎症，血管炎以及关节骨的破坏[1]。十味乳香胶囊为藏成药制剂，收载于部颁标准，主要由木香、诃子、乳香、宽筋藤等十味药组成，具有祛风燥湿的功效，临床常用于治疗RA、痛风症[2]。目前对十味乳香胶囊的认识还处于民族医药的经验表述阶段，缺乏现代药理学的系统研究。现建立胶原诱导和寒湿刺激相结合的病症模型，对十味乳香胶囊抗RA的作用进行探讨，以期为该制剂的合理开发和利用提供依据。

1、实验部分

1.1仪器、试药与动物

YLS7C足容积测定仪(济南益延科技发展有限公司)。牛Ⅱ型胶原(美国Chondrex);F5506弗氏佐剂(美国Sigma);地塞米松片(广东雷允上药业有限公司，规格：0.75 mg);十味乳香胶囊(青海普兰特药业有限公司);白细胞介素-6(IL-6)、IL-1βELISA Kit(江苏晶美生物科技有限公司);肿瘤坏死因子-α(TNF-α,美国Proteintech);抗体IL-6、IL-1β、TNF-α、CD4+、CD8+及抗原修复液(武汉赛维尔科技有限公司)。100只SPF级♂SD大鼠(西安交通大学医学部实验动物中心，合格证号：SCXK陕2018-001),体重160～200 g。

1.2方法与结果

1.2.1大鼠的造模与给药[3]

动物实验经青海师范大学实验动物伦理委员会批准。大鼠饲养于青海央宗实验动物研究中心，20～25℃,湿度40%～70%,适应性喂养7 d。参照文献将牛Ⅱ型胶原溶于0.05 mol·L-1乙酸，配成2 mg·mL-1的溶液，置4℃冰箱中过夜，与5 mg·mL-1的弗氏佐剂等体积混合，低温冰上充分研磨，使之完全乳化至乳白色黏稠液体，配制成终浓度为1 mg·mL-1的胶原。大鼠尾根部消毒、剃毛，每只皮下注射胶原0.2 mL,完成初次免疫；初次免疫7 d后重复致炎，完成二次加强免疫，方法与剂量同上。二次免疫后对各致炎大鼠每只爪单独进行评分(足趾轻微肿胀或发红计1分；足趾中度肿胀并出现红斑计2分；整个足趾出现严重的红肿计3分；踝关节肿胀、踝关节僵硬计4分),4只爪的总分即为关节炎指数(AI),AI≥4视为造模成功。第17天时，将24只造模成功的类风湿性关节炎(RA)大鼠随机均分为模型组、阳性(地塞米松)组及十味乳香高、低剂量组，另取6只正常大鼠作为空白组。十味乳香高、低剂量组每日按人体临床上限的2、1倍剂量折算后灌胃给予十味乳香(按生药量计算分别为0.567、0.284 g·kg-1),阳性组ig给予2 mg·kg-1地塞米松溶液，给药容积均为10 mL·kg-1,空白组与模型组ig给予等体积蒸馏水，连续给药28 d。

1.2.2对RA大鼠体重、关节肿胀度和关节炎指数评分的影响

从致炎前开始，每隔3 d称量并记录大鼠体重。空白组大鼠在整个实验周期间内的精神状态良好、活动自如、毛发光泽、体重增加较快。模型组大鼠在第1次免疫后，体重、外观、毛发等与空白组比较，无显著差异；在第2次免疫后，体重增长缓慢。十味乳香胶囊高、低剂量组大鼠的体重在造模第9～17天内出现不同程度的降低，随后逐渐增加。阳性组大鼠的体重在造模第13～25天后逐渐下降，随后增长缓慢(图1A)。用游标卡尺测量大鼠左后足跖厚度，每3 d测量1次，计算大鼠足肿胀度=(致炎后足跖厚度-致炎前)/致炎前。造模前在大鼠双侧踝关节处均进行标记，造模成功后，用足趾肿胀仪测量踝关节标记以下部位的足趾体积，每只踝关节每次测量3次并取平均值，且3次测量的最大数值与最小数值之差小于1。每3天测量大鼠足踝关节体积，直至实验结束。由图1B、图1C可知：空白组大鼠的足跖厚度和踝关节肿胀度在实验期间无显著变化；二次免疫后(免疫第13天后),模型组和各给药组大鼠的踝关节、足跖多关节逐渐出现红肿；在第17天时，模型组和各给药组大鼠关节炎指数评分均大于4分，表明造模成功。大鼠ig给予十味乳香胶囊不同剂量和地塞米松后，踝关节和足跖肿胀度降低，且随着给药时间的推进，其肿胀度呈逐渐减轻的趋势。

1.2.3对RA大鼠血清中炎症因子的影响

末次给药后，水合氯醛麻醉大鼠，于腹主动脉取血，置离心管中，静置20 min,以3×103 r·min-1离心10 min,收集上清液，按照ELISA试剂盒说明书操作测定大鼠血清中炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。由图2可知：与空白组大鼠比较，模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量均极显著增加(P<0.01);与模型组大鼠比较，十味乳香胶囊高、低剂量组和阳性组大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量显著降低(P<0.05、P<0.01)。由图3免疫组化染色图可知：与空白组大鼠比较，模型组大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α免疫阳性的细胞(图中被染成棕色)数目显著增加；与模型组比较，十味乳香胶囊和阳性组IL-6、IL-1β、TNF-α免疫阳性的细胞数目减少。

图1十味乳香胶囊对RA大鼠体重(A)、足跖厚度(B)和关节肿胀度(C)的的影响

图2十味乳香胶囊对RA大鼠血清中IL-6(A)、IL-1β(B)和TNF-α(C)含量的影响

图3十味乳香胶囊对RA大鼠滑膜组织中IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白表达的影响(×200)

1.2.4对RA大鼠踝关节组织病理学的影响

用水合氯醛麻醉大鼠后，取大鼠右后肢，去除右后肢皮肤肌肉，保持踝关节的完整性，PBS清洗，浸泡组织于中性甲醛固定液，固定24 h后流水冲洗，随后浸泡至70%乙醇，EDTA脱钙，石蜡包埋，常规切片(5μm),进行HE和番红-固绿染色，于光学显微镜下观察关节组织的病理变化并采集图像(图4)。由图可知：与空白组比较，模型组大鼠的关节腔狭窄，滑膜明显增厚且侵袭到软骨，炎性细胞浸润；十味乳香胶囊和阳性组大鼠的关节滑膜增生明显减轻，炎性细胞浸润减少与空白比较，模型组大鼠的关节面不平滑且结构损伤，软骨细胞(红色)明显减少，伴有滑膜增生；十味乳香胶囊和阳性组大鼠软骨细胞(红色)增加，滑膜增生显著改善，关节面平滑。

1.2.5对RA大鼠脾脏组织病理学和免疫阳性细胞的影响

取大鼠脾脏，PBS清洗，除去血滴与脂肪，中性甲醛固定，制作石蜡包埋组织蜡块，常规切片(5μm),行HE染色，在光学显微镜下观察脾脏的形态学病理学变化并拍照。与空白组比较，模型组大鼠脾脏组织中的红髓和白髓界限模糊，白髓的结构模糊，面积缩小，脾小结的数量变少；与模型组比较，十味乳香胶囊和阳性组的红髓和白髓界限清晰，白髓范围更加明显，面积增大，脾小结数目增加(图5)。取大鼠的免疫组织切片，于60℃烤箱过夜，脱蜡水化，抗原修复，血清封闭，DAB显色脱水，透明中性树胶封片，于光学显微镜下观察并拍照，大鼠的脾脏组织内棕黄色颗粒状的细胞为CD4+和CD8+免疫阳性的细胞。由图6可知：与空白组大鼠比较，模型组大鼠CD4+免疫阳性的T细胞数目显著增加，CD8+免疫阳性的T细胞数目减少，CD4+/CD8+的比例升高；与模型组比较，十味乳香胶囊和阳性组CD4+免疫阳性的T细胞数目减少，CD8+免疫阳性的T细胞数目增加，CD4+/CD8+比例降低。

图4十味乳香胶囊对RA大鼠踝关节组织病理学的影响(×200)

图5十味乳香胶囊对RA大鼠脾脏组织病理学的影响(×200)

图6十味乳香胶囊对RA大鼠脾脏CD4+和CD8+T细胞的影响(×400)

1.2.6对RA大鼠脏器指数的影响

采血后将大鼠麻醉处死，完整摘取脾脏和胸腺，去除筋膜及脂肪组织，以预冷的生理盐水清洗后用滤纸蘸去水分，准确称重，并计算脏器指数(g·g-1)。脾脏指数=脾脏质量/体质量；胸腺指数=胸腺质量/体质量。由图7可知：与空白对照组比较，模型组大鼠的脾脏指数显著增加(P<0.01),胸腺指数无显著变化；与模型组比较，十味乳香胶囊高、低剂量组和阳性组大鼠的脾脏指数均显著降低(P<0.01),胸腺指数无显著变化。

图7十味乳香胶囊对RA大鼠脏器指数的影响

1.2.7统计学分析

采用Graphpad prism8.0统计软件作图，结果以

表示，组间比较用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2、讨论

病证结合模型将传统医学的“证”与现代医学的“病”相结合，更符合传统药物的应用特点。胶原诱导的关节炎(CIA)模型是目前应用最广泛的类风湿性关节炎(RA)模型[4]。因此，文中研究在胶原诱导的RA大鼠模型的基础上，加入寒湿刺激因素，建立RA病证结合模型。在二次免疫后(造模第13天),模型组大鼠的足跖关节和踝关节呈不同程度的红肿，足跖厚度和踝关节肿胀度显著增加；在连续ig十味乳香胶囊和地塞米松28 d后，大鼠的上述症状得到了不同程度的改善，提示十味乳香胶囊对胶原诱导和寒湿刺激相结合的RA模型大鼠具有一定的治疗作用。在RA的发生和发展过程中，炎症因子水平的失衡，尤其是促炎因子的过度表达，会导致关节炎炎症损伤的病变，进而表现为关节滑膜增生，软骨退行性病变[5]。促炎因子白细胞介素-6(IL-6)、IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达在RA患者中显著升高[6]。经十味乳香胶囊和地塞米松治疗后，RA大鼠血清和滑膜组织中IL-6、IL-1β和TNF-α的含量显著降低；结合踝关节滑膜病理切片和番红固绿染色结果，推测十味乳香胶囊对RA的治疗作用可能与降低炎症因子水平有关。RA作为一种自身免疫性疾病，免疫病理损伤的过程一方面与炎症因子水平的失衡有关，另一方面T淋巴细胞也是RA发生发展的主要参与者[7]。T淋巴细胞的功能与其亚群CD4+和CD8+T细胞的相对组成密切相关。模型组大鼠的脾脏指数升高，脾脏组织白髓和红髓界限模糊，脾小结数量减少，CD4+T细胞数目增加，CD8+T细胞数目减少；而十味乳香胶囊可降低大鼠脾脏指数，改善CD4+T和CD8+T细胞的比例。据文献报道：在十味乳香丸治疗关节炎的分子机制中，T细胞受体介导的信号通路和TNF信号通路参与了关节炎的治疗，IL-6、IL-1β在这些信号通路中发挥了主要作用，与文中结果一致[8]。综上，藏药十味乳香胶囊对RA的作用机制可能是通过下调IL-6、IL-1β、TNF-α的含量，降低CD4+/CD8+T细胞比例，进而减轻机体的炎症反应，改善关节炎症。

参考文献:

[2]招嘉文,祝清灿,魏俊校,等.藏药十味乳香胶囊质量标准研究[J].中国现代中药,2017,19(1):111-115.

[3]李乐,杨雨琦,谭玉婷,等.塞来昔布超饱和自微乳的药效学研究及安全性评价[J].华西药学杂志,2023,38(6):603-608.

[5]田锋祥,张明菲,申美玉,等.三七总皂苷对调节性T细胞再分化为辅助性T细胞的影响[J].华西药学杂志,2024,39(1):33-36.

[8]李巧云,蒙凤萍,熊慧,等.十味乳香丸治疗关节炎的网络药理学机制研究[J].时珍国医国药,2021,32(1):64-68.

基金资助:青海省科技厅应用基础研究项目(2020-ZJ-743);青海省“昆仑英才•高端创新创业人才”项目(2020);青海师范大学博士科研启动经费(2020);

文章来源:陈海娟,高禹涵,徐丽,等.十味乳香胶囊对类风湿性关节炎大鼠的治疗作用[J].华西药学杂志,2024,39(03):274-278.