骨关节炎是骨科疾病的一种，随着年龄的增长，患病人数不断增加，该病在中老年人群中出现概率较大[1]。骨关节炎是因关节软骨的退行性变使软骨及关节周围肌肉损害而引起的进展性关节疾病[2,3]。骨关节炎的发病机制是关节内部的软骨组织出现病变，导致关节软骨局部结构性破坏及病变，前期表现不是十分明显，主要症状为关节内部病变、持续钝痛等。骨关节炎主要在人手关节、膝关节等部位发病，主要表现为行动不便、肿胀等[4]。发病原因有多种因素，其中包括年龄、性别等。随着病情发展，逐渐会出现病变关节的夜间休息痛、半月板损伤等，由于疼痛，关节的正常活动会受到限制，对患者日常生活影响较大[5]。Janus激酶(JAK)/信号转导及转录激活蛋白(STAT)是近年来研究的重点通路之一，JAK/STAT在细胞的各个发育过程中占有关键位置。研究显示，JAK2/STAT3信号转导子与转录激活子参与软骨细胞的增殖，在多种骨关节疾病中发挥重要作用[6]。JAK/STAT在骨关节中表达降低，其缺失能够推动炎症发生发展。补肾通络方具有强筋壮骨、活血化瘀、舒筋通络，标本兼治的功效[7]。且多项研究表明，补肾通络方对膝骨关节炎治疗有效，但其具体的作用机制尚不明确[8]。因此，本文探讨补肾通络方对骨关节炎大鼠JAK2/STAT3及骨代谢的影响。

1、材料与方法

1.1 动物

在广东省医学SD大鼠中心购买25只SD雄性大鼠，体质量187～240 g, 4～6周龄。许可证号：SCXK(粤)2019-0002,在常温下湿度为55%,模拟黑白交替无菌饮食2 w, 按照《实验动物管理条例》规定进行实验。

1.2 模型制备与分组

将所选取的大鼠根据是否造模及给予药物剂量不同分为：模型组(MO组):制作骨关节炎大鼠模型；健康组(HE组):正常培养，不做任何处理；低剂量组(LD组):制作骨关节炎模型后给予低剂量补肾通络方进行治疗；中剂量组(MD组):制作骨关节炎模型后给予中剂量补肾通络方进行治疗；高剂量组(HD组):制作骨关节炎模型后给予高剂量补肾通络方进行治疗；每组5只。

给予骨关节炎模型大鼠骨关节注射木瓜蛋白酶溶液，剂量为0.15 ml, 浓度为4%,每次注射0.2 ml/肢，注入膝关节腔内，每3 d注射1次，连续注射3次，HE组不做任何处理。造模成功[9]7 d后，分别给予LD组、MD组、HD组补肾通络颗粒制成的混悬液灌胃，1次/d, 剂量分别为0.52、 1.04、2.08 g/kg, MO组、HE组给予等体积生理盐水灌胃，持续治疗28 d。在此期间，所有大鼠在相同环境下生活。实验完成后，对大鼠行为学及表征评估完成后，将大鼠分别杀死并选取关节软骨组织，检测病变程度并保存，用于后续实验。补肾通络颗粒成分：骨碎补9 g、鸡血藤15 g、川芎10 g、穿山龙10 g、白芍12 g、桑寄生15 g、川牛膝12 g。

1.3 仪器与试剂

全自动生化仪购自格利特科技公司(济南);胎牛血清(上海传秋，中国)。JAK抗体(圣克鲁斯生物技术);STAT抗体(景杰生物);苏木素-伊红(HE)试剂盒(西安赫特生物);蛋白电泳仪(北京东方瑞利科技);显微镜(北京冠普佳科技);超低温冰箱[甘沃实业(上海)]。

1.4 大鼠行为学及表征评估

从造模前开始，每周记录大鼠体质量变化、膝关节肿胀程度及活动度，观察实验动物的一般精神状态如活动、饮水进食情况等并测量记录患侧膝关节宽度，要求由2人同时对其进行评估并各自记录数值，取其平均值，2次评估人员相同。

1.5 HE染色法检测病理形态

软骨组织石蜡包埋后，脊髓组织5 μm切边，脱蜡10 min后，利用95%乙醇水化，采用碱性苏木素进行染色15 min, 磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，蒸馏水清洗，再利用0.5伊红染色3 min, PBS透明，软骨组织病理采用光学显微镜观察。

1.6 软骨病变程度判定标准

采用国际骨关节炎研究学会(OARSI)评分对大鼠软骨病变程度进行判定。0分：软骨表面光滑无明显炎症，1～2分：可见明显水肿或纤维变性，表面出现磨损，3～4分：软骨浅层区域脱层，出现溃疡，5～6:关节表面外形变性，关节边缘骨赘形成。

1.7 Western印迹法检测JAK2/STAT3蛋白

另取10只大鼠随机分为两组，用1.2中方法进行造模，造模成功后，一组加入JAK2抑制剂，为JA组，一组加入STAT3抑制剂，为ST组，持续给予28 d, 处死大鼠后取软骨组织，然后对HE组、MO组、LD组、MD组、HD组、JA组及ST组JAK2/STAT3蛋白进行检测。首先取各组软骨组织进行裂解并提取核蛋白，并对核蛋白的浓度进行测量，分装后，保存在-20 ℃的环境中。将提取出的蛋白溶液和缓冲溶液进行混均，按照4∶1的比例，为了让蛋白质变性需将蛋白溶液全部进行煮沸处置。50 μm蛋白样品放置聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加脱脂奶粉，封闭，时长为1 h。加入一抗后进行Tris缓冲盐水(TTBS)漂洗，每次漂洗10 min, 一共进行3次漂洗，最后加入二抗对溶液进行稀释，封闭1 h。TTBS漂洗，二胺基联苯胺(DAB)显色，拍照。

1.8 酶联免疫吸附试验检测骨代谢

实验结束后，各组尾静脉取血，在3 000 r/min的条件下低温离心20 min, 酶联免疫吸附试验检测Ⅰ型胶原交联C末端肽(CTX)-1及破骨细胞(OC)骨代谢指标含量，实验步骤严格按试剂盒说明书进行操作，实验完成后立即用酶标仪在450 nm 波长处，测定每孔的吸光度(A)值，通过标准曲线，计算CTX-1及OC含量。

1.9 统计学分析

采用SPSS22.0软件进行方差分析，事后检验采用Bonferroni法进行组间两两比较。

2、结果

2.1 各组行为学及表征评估比较

建模前，各组体质量及双后肢瞬时速度差异无统计学意义(P>0.05)。给药14、28 d, 与 HE组比较，MO组体质量、双后肢瞬时速度明显降低(P<0.05);与MO组比较，MD 组、HD 组体质量、双后肢瞬时速度显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组体质量及双后肢瞬时速度比较

2.2 HE染色检测软骨组织代谢

HE组软骨组织表面光滑，结构完整，无病变现象；MO组软骨组织体积缩小，表层结构细胞明显减少，外形不规则，细胞核固缩，细胞数目减少；HD组软骨组织结构基本完整，但基质也出现轻微减少现象，表面不齐。与MO组比较，LD组、MD组、HD组软骨组织出现明显改善，其中HD组软骨组织状态最佳。见图1。

图1 各组软骨组织(HE染色，×400)

2.3 各组软骨组织OARSI评分比较

给药14 d时，MO组OARSI评分最高，LD组、MD组、HD组OARSI评分相近，给药28 d时，LD组、MD组、HD组骨关节炎情况逐渐好转，且HD组OARSI评分最低，明显低于MO组、LD组(均P<0.05),MO组病情逐渐恶化。见表2。

2.4 各组骨代谢指标比较

与HE组相比，MO组CTX-1、OC含量明显升高(P<0.05);与MO组相比，LD组、MD组、HD组CTX-1、OC含量明显降低，且MD组比LD组降低明显，HD组比MD组降低明显(P<0.05)。见表2。

表2 各组软骨组织OARSI评分、血清CTX-1、OC含量比较

2.5 各组软骨组织中JAK2/STAT3蛋白含量比较

与HE组相比，MO组软骨组织JAK2/STAT3蛋白表达显著降低(P<0.05);与MO组比较，LD组、MD组、HD组、JA组、ST组软骨组织中JAK2/STAT3蛋白表达显著上升，MD组较LD组升高明显，HD组较MD组升高明显(均P<0.05);JA组、ST组与HD组以上指标无明显差异(P>0.05)。见表3、图2。

表3 各组软骨组织中JAK2/STAT3蛋白含量比较

图2 各组软骨组织中JAK2/STAT3蛋白表达

3、讨论

骨关节炎是一种比较常见的关节性病变，在年轻时，普通人的骨关节就可能有炎症，但多数无明显症状[10]。骨关节炎的发病率极高，但根治又非常困难，因此，该病对患者生活的影响极大，但其诊断和预后一直缺乏特异性的实验室指标[11]。随着病情的发展，逐渐会出现病变关节的夜间休息痛、关节间隙变窄等，由于疼痛，关节的正常活动会受到限制，最终影响患者正常生活。该病的发生原因复杂多变，通常与患者年龄等有关，绝经女性发病的主要原因为体内雌激素大量缺失，导致软骨发生病变，最终发展为骨关节炎[12,13]。

膝关节炎是一种比较常见的关节性病变，很多人在青年时期就患有该病，但多数无明显症状。中医认为骨关节炎多由外伤、劳损等导致筋骨病变，使膝部的筋脉痹阻，气血瘀滞，筋骨失养。治宜祛风散寒除湿、通络活血止痛以达到寒散湿除、瘀祛痛止的目的[14]。本文结果显示，补肾通络方干预后可明显改善大鼠病理形态、骨形成及骨吸收失衡状态，从而发挥对骨组织的保护作用。补肾通络方中药萃取物具有补肾活血、通络止痛功效，能够对骨关节炎患者有一定的临床疗效。方中川牛膝具有补肝肾、强筋骨、活血通络、引火下行之功效，还可引药入经；桑寄生归肝、肺经，具有袪风湿、益肝肾、强筋骨、活血通络之功效；鸡血藤、川芎活血，散瘀止痛；白芍归肝脾经，能平肝止痛，养血调经，舒筋通络；川芎具有改善血液循环的功效；诸药合用，共奏散除寒湿、通络止痛之功[15,16]。补肾通络方作用于机体后，能够显著抑制疼痛，消除软骨部位的炎性因子，促进软骨细胞生长。部分研究显示，补肾通络方能够保护关节，减少运动时产生的摩擦，改善软骨病变程度，进而达到治疗的目的[17]。杨帆等[18]研究显示，补肾通络方能够维持膝骨关节炎大鼠体内成骨细胞(OB)/OC活动的平衡，抑制或延缓破骨，促进成骨发育，改善骨质代谢水平，缓解KOA病情进一步进展，其作用机制为下调软骨组织中受体活化因子κB配体(RANKL)水平，上调OPG含量。徐昌等[19]研究显示，自拟补肾通络方对骨性关节炎患者的治疗效果显著，能够明显患者功能障碍指数(ODI)评分，提高患者关节功能，减轻疼痛。

有报道显示，JAK/STAT信号通路在调节生理过程中发挥着不可或缺的作用，能够影响细胞的免疫调节等，提示JAK/STAT表达水平能够参与骨关节炎及其他相关骨疾病的生理过程[9]。有研究表明，JAK2/STAT3信号通路参与机体内多种细胞的增殖、凋亡过程，在健康生物体内JAK2/STAT3信号通路呈现高表达，在患病生物体内JAK2/STAT3信号通路呈现低表达，表明其高表达能明显促进细胞凋亡、减少细胞寿命，因此，JAK2/STAT3信号通路的表达水平对细胞的生长、凋亡具有重要作用[20]。在实验中发现，补肾通络方作用于患病大鼠时，大鼠体内JAK2/STAT3表达水平随之下降，且补肾通络方用药时间与JAK2/STAT3表达水平呈负相关，即补肾通络方用药时间越长，JAK2/STAT3表达水平越低[21]。补肾通络方与JAK2/STAT3信号通路的关系为骨关节炎的诊断和治疗发展提供新的科研方向[22]。JAK2/STAT3在骨关节炎内表达降低，当JAK2识别细胞外信号发生磷酸化激活后能够使下游STAT3发生磷酸化，p-STAT3具有转录激活活性，能够调节下游多种基因的表达并参与抗炎作用。STAT3被激活对骨关节炎大鼠的软骨组织增生具有抑制作用，其中，STAT3的显著表达可以抑制软骨细胞凋亡，从而发挥治疗作用。而激活JAK2/STAT3可导致软骨细胞大量凋亡，同时通过补肾通络方上调磷酸酶的作用，促进JAK2/STAT3的激活，从而达到治疗作用[23]。研究发现，通过激活实验大鼠软骨组织JAK2/STAT3,可保护实验大鼠的软骨细胞，认为软骨组织与JAK2/STAT3有着重大的关系，这对于骨关节炎乃至其他疾病的治疗与防治都有关键性的作用[24]。

综上，基于网络药理学补肾通络方对骨性关节炎大鼠有显著治疗作用，能够明显改善关节软骨的代谢情况，改善软骨病变程度，显著升高双后肢瞬时速度，这一作用机制可能与补肾通络方提升大鼠体内JAK2/STAT3表达水平有关。

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基金资助:河北省卫生健康委医学科学研究课题计划项目(No.20191769);

文章来源:张晓丹,胡铭杨,索娜.补肾通络方对骨关节炎大鼠JAK2/STAT3及骨代谢的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(21):5316-5320.