骨关节炎是一种退行性关节疾病，全身骨关节均有罹患该疾病的可能。骨关节炎的具体致病机制尚不明确，病因亦涉及多种因素，如负荷过重、衰老、遗传因素、内分泌紊乱、运动损伤等[1]。骨关节炎的主要病理特征包括软骨降解、软骨下骨硬化及骨赘形成。软骨基质降解曾被认为是骨关节炎中最初也是最核心的病理改变[2]，但近年来更多的研究着眼于探讨软骨下骨的异常骨重塑在骨关节炎发生发展中的作用，以及软骨和软骨下骨两者作为一个统一的功能单位之间的相互作用和因果关系[3,4,5]。

软骨下骨是由矿化基质构成的结缔组织，其中包含各种骨组织所特有的细胞类型，如成骨细胞、骨细胞及破骨细胞等[6]。骨细胞在包括关节软骨下骨在内的成熟骨组织的细胞成分中的占据比例高达90%-95%[6]。在骨矿化基质中，骨细胞可通过细胞突触与相邻其他骨细胞、成骨细胞相连以感应并传导力学信号[7]。软骨下骨的异常骨改建在骨关节炎发展中起重要作用[3,8]，但骨细胞作为具有传导机械应力效能的细胞，其在骨关节炎发生发展中的作用尚不完全清晰。

为进一步探讨软骨下骨和骨细胞在骨关节炎初期的改变及其在骨关节炎进展中的可能作用机制，此次研究通过建立小鼠膝骨关节炎动物模型，观察骨关节炎小鼠膝关节中软骨下骨板和软骨下骨松质的病理学及影像学特征，以及其中骨细胞的形态学改变及特异性蛋白的表达变化。

1、材料和方法

1.1 设计

随机对照动物实验，数据间比较采用t检验。

1.2 时间及地点

于2015年6月至2016年6月在四川大学华西口腔医学院及口腔疾病研究国家重点实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物

10周龄雄性C57BL/6小鼠共20只，平均体质量(20±3)g，购于四川大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK(川)2013-185。

1.3.2 实验试剂

苏木精-伊红染液(上海Sigma-Aldrich贸易有限公司)，甲苯胺蓝染液(上海歌凡生物)，抗sclerostin抗体(R&D公司，美国)，密抛光膜、抛光液(北京国瑞升公司)，次氯酸钠溶液(成都市科龙化工试剂厂)。

1.3.3 实验仪器

Micro-CT(Scancoviva40，瑞士)，石蜡包埋机(德国Leica公司)，石蜡切片机(德国Leica公司)，扫描电镜超声清洗机(Branson200，必能信超声有限公司，美国)，体视显微镜(NIKONSMZl000，日本)，扫描电镜(InspectFFEI，荷兰)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验设计与分组

选取10周龄C57BL/6雄性小鼠共20只，称质量后将相同体质量的小鼠放入同一笼中，共计5笼(编号1#-5#)。另取空笼2只，编号为骨关节炎组和对照组。按顺序从1#-5#笼中每次取小鼠一只相继放入骨关节炎组及对照组笼中，直至骨关节炎组10只，对照组10只。两组小鼠均以右侧后肢为实验侧，骨关节炎组小鼠右侧后肢膝关节使用前交叉韧带横切术构建关节不稳定模型以诱导骨关节炎形成[9]，对照组小鼠右侧后肢膝关节行假手术[10]。术后4周处死小鼠并收取膝关节样本[11,12]，分别进行组织学染色、Micro-CT扫描、数据分析及扫描电镜观察。

1.4.2 小鼠膝关节炎模型的建立

使用1%戊巴比妥钠(80mg/kg)进行腹腔注射麻醉；消毒术区，备皮，于膝关节前方的皮肤处作约5mm长的纵行膝关节内侧切口。直视下分离膑腱，将膑腱(连同其中的髌骨)轻柔拨向关节外侧，用手术刀的尖端划断前交叉韧带。采用抽屉试验确认前交叉韧带是否完全切断，之后使用4-0可吸收缝线分层缝合关节腔软组织与皮肤。假手术组仅做膝关节内侧切口，不予切断前交叉韧带，之后直接以相同方法缝合关节腔软组织和皮肤。术后给予小鼠正常饮食。

1.4.3 组织病理学染色

术后4周麻醉处死小鼠，获取膝关节样本，在进行组织学染色前均经过40g/L多聚甲醛溶液固定，10%EDTA溶液脱钙、乙醇梯度浓度脱水、二甲苯透明以及石蜡包埋。包埋后的组织进行连续切片，切片方向与膝关节的冠状面平行，每张切片厚4μm，切片以实验分组的顺序进行编号并作相应标记。

苏木精-伊红染色步骤：切片放入二甲苯中脱蜡2次，每次10min；乙醇梯度水化每次30s；清水冲洗后，苏木精着色5min；流水洗去多余染液后用0.5%的盐酸乙醇分色；流水冲洗2min；氨水返蓝5min；流水冲洗2min；浸入伊红染色液3min；冲洗1min；体积分数75%乙醇分色2次各10s;95%乙醇脱水2次各10s;100%乙醇脱水2次各30s；二甲苯透明2次各60s；中性树胶进行封固。

SOST/sclerostin免疫组化染色步骤(检测骨硬化蛋白阳性细胞)：脱蜡及梯度脱水同苏木精-伊红染色；蒸馏水洗2次，每次10min；体积分数3%H2O2封闭20min;PBS洗2次，每次5min；抗原修复：切片滴加抗原修复液放入37℃恒温孵箱20min;PBS洗2次，每次5min；兔封闭血清(1∶20)封闭，37℃，30min，后甩去封闭液；切片上滴加羊抗鼠骨硬化蛋白一抗(1∶100)，标记，置于4℃冰箱过夜；PBS洗2次，每次5min；生物素二抗，兔抗羊(1∶100)37℃，60min;PBS洗2次，每次5min；辣根酶标记亲和素(1∶100)37℃，60min;PBS洗2次，每次5min;DAB显色，镜下观察，2min后终止反应；蒸馏水洗，苏木精复染3min，盐酸乙醇分色，氨水返蓝；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固；空白对照采用PBS代替一抗，其余步骤同上。

甲苯胺蓝染色步骤：将干燥切片放入氢氧化钾的无水乙醇饱和溶液中浸泡10-15min，无水乙醇清洗3次；乙醇梯度水化；水洗3次，每次5min；浸染于甲苯胺蓝染液中10min；水洗去多余染液；乙醇梯度脱水；二甲苯透明；中性树胶封固。

根据国际骨关节炎研究学会(OsteoarthritisResearchSocietyInternational,OARSI)评分对小鼠骨关节炎模型建立后骨关节炎严重程度进行评估，以甲苯胺蓝染色中观察到的关节软骨损伤程度对各组小鼠膝关节进行0-6分(由低到高)的OARSI评分[13]。

1.4.4 Micro-CT检测

各组小鼠的膝关节样本采用40g/L多聚甲醛溶液固定后，分别对整个膝关节进行Micro-CT扫描(包括胫骨和股骨各5mm,X射线管电压：70kV；电流：114μA；暴露时间：1180ms)，每个样本扫描30个连续的断层，扫描后的数据使用配套软件进行分析，对相应区域的骨矿化密度及相对骨体积分数(bonevolume/trabecularvolume,BV/TV)值进行测量分析。

Micro-CT扫描选取的检测部位分别为软骨下硬骨板及软骨下骨松质。

1.4.5 扫描电镜检测

用2.5%戊二醛溶液固定样本，乙醇梯度脱水，使用环氧树脂AB胶包埋，使用梯度粒度的砂纸加水进行打磨至关节矢状面的中线处，使用梯度粒度的金刚砂液在梯度粒度的打磨纸上进行抛光，20%-37%的磷酸酸蚀，蒸馏水轻柔冲洗，用20%-37%的磷酸酸蚀样本，超声清洗、干燥，喷金后在显微镜下观察。

1.5 主要观察指标

(1)骨关节炎膝关节软骨-骨交界的组织学变化；(2)骨关节炎膝关节软骨下骨板及软骨下骨松质的骨矿化密度相关参数；(3)骨关节炎膝关节软骨下骨中骨细胞的形态学改变。

1.6 统计学分析

实验所获取的数据以均数±标准误表示，采用SPSS17.0统计软件进行t检验分析，以P<0.05作为差异有显著性意义的标准。

2、结果

2.1 实验动物数量分析

纳入雄性C57BL/6小鼠20只，随机分为2组，全部进入结果分析，无脱落。

2.2 小鼠骨关节炎膝关节软骨下骨的组织病理学改变

两组小鼠术后4周的膝关节苏木精-伊红染色结果，见图1A。

假手术组小鼠膝关节苏木精-伊红染色结果显示，软骨组织未见明显病理改变，软骨细胞层次清晰，排列规则软骨层完整，厚度正常；潮标平滑而连续(白色虚线)；软骨下骨厚度正常。

骨关节炎组小鼠膝关节苏木精-伊红染色结果显示，软骨组织表层的软骨细胞大部分消失，仅有小部分区域尚存在完整的中间层(即串珠状排列的软骨细胞)，深层出现较多肥大化的软骨细胞。软骨层厚度变薄；潮标崎岖不平(白色虚线)；软骨下骨板增厚。

对两组小鼠膝关节进行甲苯胺蓝染色，并进行OARSI评分，见图1B,C。相较于假手术组，骨关节炎组小鼠OARSI评分较高，差异有显著性意义(P<0.05)。

2.3 Micro-CT检查分析结果

软骨下硬骨板检测选取区域，见图2A所示(黄色线条圈定区域)，软骨下骨松质检测选取区域，见图2B所示(红色线条圈定区域)。假手术组及骨关节炎组小鼠膝关节Micro-CT三维重建及断层图，见图2B。假手术组及骨关节炎组小鼠膝关节的软骨下硬骨板及软骨下骨松质区域的骨矿化密度及BV/TV的测量和统计分析结果如下：

2.3.1 两组小鼠软骨下骨松质的Micro-CT结果

(1)骨矿化密度值：相较于假手术组，骨关节炎组小鼠软骨下骨松质的骨矿化密度值较低(P<0.05)，见图2C;

(2)BV/TV值：相较于假手术组，骨关节炎组小鼠软骨下骨松质的BV/TV值较高(P<0.05)，见图2D。

2.3.2 两组小鼠软骨下硬骨板的Micro-CT结果

(1)骨矿化密度值：相较于假手术组，骨关节炎组小鼠软骨下硬骨板的骨矿化密度值较低(P<0.05)，见图2E;

(2)BV/TV值：相较于假手术组，骨关节炎组小鼠软骨下硬骨板的BV/TV值较高(P<0.05)，见图2F。

2.4 扫描电镜下小鼠骨关节炎膝关节的骨细胞形态、排列及软骨下骨矿化沉积形态的变化

2.4.1 骨细胞形态及排列

假手术组中骨细胞呈梭形，其长轴与骨质沉积的方向一致，且与邻近骨细胞长轴基本一致，排列规律且有序，见图3A。骨关节炎组中骨细胞体积明显增大，主体部分成圆形或不规则形，成簇排列且无明显规律，与骨质沉积方向不一致，见图3B。

2.4.2 软骨下骨矿化沉积形态

假手术组中软骨下骨骨板中的骨质逐层有序排列呈分层状，与软骨组织间有清晰平滑的交界线，见图3A。骨关节炎组中软骨下骨骨板的骨质排列紊乱，无明显分层，矿化组织的沉积明显不均匀，形态呈不规则的结节状，与软骨组织间的交界线崎岖且不平滑，见图3B。

2.5 小鼠骨关节炎膝关节中骨细胞相关因子SOST/sclerostin在软骨下骨中的表达变化

两组小鼠术后4周的膝关节SOST/sclerostin免疫组化染色结果见图4。骨硬化蛋白仅在钙化组织中表达，即在钙化软骨及软骨下骨板中表达。相较于假手术组，骨关节炎组小鼠膝关节中SOST/sclerostin免疫组化染色阳性细胞数明显较少(P<0.05)。

3、讨论

当今骨关节炎被认为是一种伴有全关节受累、持续性损伤、疼痛及残疾的疾病，是一种以炎症、免疫、中枢神经系统异常为核心因素的“多种疾病”的总和[14,15]。以往多数研究结果及临床实践认为，骨关节炎最主要的病损在于关节软骨的磨损和撕裂，而近期研究发现，软骨下骨的失衡与滑膜炎可能是最初存在的病损和导致关节炎进一步进展的原因[4,14,15,16,17]，软骨下骨硬化的发生，会导致软骨-骨连接界面的弹性减少，进一步引起和加剧表面软骨基质的降解[18]。

此次研究将骨关节炎早期软骨下骨的形态学特征进行多维度观察，在Micro-CT中对软骨下骨板和软骨下骨松质分别进行测量分析，并在扫描电镜检测中直观反映出骨细胞明显的形态学变化，为软骨下骨形态学改变在骨关节炎进展中的作用提供了新的依据。此次研究最主要的发现是小鼠膝关节在骨关节炎早期即出现明显的软骨下骨形变并伴随着关节软骨的降解，软骨下骨的骨矿化密度值下降然而同时BV/TV值出现升高；扫描电镜下软骨下骨的微观结构和其中骨细胞的结构与排列方式在诱导形成骨关节炎后出现明显的改变，与此同时，骨硬化蛋白的表达出现明显降低。

骨关节炎早期出现的病理改变可早于临床症状的出现。在关节软骨中，主要表现为软骨基质水肿，以及继而出现的关节软骨表面微裂隙和软骨基质的进一步丧失。在软骨下骨中，主要病理改变为软骨下骨皮质骨改建增加，以及继而出现的软骨下骨多孔性的增加。随着病变进展，钙化软骨或软骨下骨可能出现不同程度的暴露。骨关节炎晚期，软骨细胞出现肥大化并伴随凋亡，钙化软骨范围变宽并向表层覆盖的关节软骨移行伴随多条潮标的形成。而软骨下骨中，可见骨细胞的凋亡，骨赘在关节边缘形成，软骨下骨磨平且形成微小的囊腔[19]。

软骨下骨硬化与骨重塑改变相关[20]，其表现包括软骨下骨板的增厚及软骨下骨小梁的骨量及微结构的改变等[21]。骨重塑的异常影响了骨矿化沉积，继而引起负重时软骨下骨形态在宏观上和微观上的改变[22,23]。人类膝关节骨关节炎早期即可观察到软骨下骨重塑的增加伴随骨丧失，并被认为是骨关节炎进展的决定因素[24,25]。也有学者在动物实验中发现，骨关节炎早期软骨下骨会出现暂时性骨丧失[26,27]，在骨关节炎进展的过程中，软骨下骨皮质逐渐增厚[28]。近年研究显示，应力负荷的减少会引起小鼠膝骨关节中软骨下骨的骨量降低[29]。然而骨关节炎早期出现骨重塑异常和骨结构改变的潜在机制仍不清晰[3]。

此次研究发现，以前交叉韧带横切手术的方式在4周后即可诱导小鼠膝关节产生明显的骨关节炎早期表型，包括软骨中细胞的改变、软骨层变薄，尤其是软骨-骨交界处的潮标形态出现了明显改变，潮标崎岖不平，表明软骨下骨表面形态的非均质性改变在关节炎初期即出现。此次研究在Micro-CT检测中进一步发现，软骨下骨的两个组成部分，即直接衬垫于软骨下方的软骨下骨板以及软骨下骨松质，均出现骨矿化密度值的减少(P<0.05)及BV/TV值的增加(P<0.05)，提示骨关节炎早期软骨下骨硬化并不是骨质的“质”与“量”的同时增加，而是“量”的增加(BV/TV值的增加)和“质”的减少(骨矿化密度值的减少)并存。这一改变可能与软骨下骨稳态被破坏造成骨重塑异常有关[30]。

骨细胞是均匀分布于矿化骨基质深层的终末分化细胞，在骨组织的细胞成分中占据最大比重。骨细胞的胞浆呈树枝状突起形成类似微管的结构，微管内的液体具有接收和传导力学变化，并将力学刺激转化为生物学信号以进一步调控骨代谢的能力[31]。这一微管结构与周围的骨细胞、骨表面的成骨细胞以及骨髓相连，构成与神经元类似的级联网状结构[32]，这一细胞间网状连接模式被学者们认为在保持骨稳态的过程中发挥着核心且多样的作用[33,34,35]。骨细胞作为机械应力的传递者，在骨细胞与骨细胞之间，以及骨细胞与成骨细胞、破骨细胞间的力学信号传递中起着关键作用。机械刺激对骨细胞的生存和活性起着重要的调节作用，应力缺失会引起骨质丧失和骨细胞凋亡。关节的异常受力被广泛认为是造成骨关节炎的主要原因之一，因此，骨细胞以作为传导机械应力为主要功能的细胞成分，其在骨关节炎发生发展的过程中有发生明显变化的可能[36,37]。

SOST/sclerostin是Wnt/β-catenin信号通路的胞外抑制剂，通过竞争性结合跨膜辅助受体LRP5/6抑制成骨细胞分化及活性。SOST/sclerostin在成熟的骨细胞中表达，其在受到机械应力刺激时出现明显的表达变化，是应力刺激下骨重塑过程中不可或缺的成分之一[38]。SOST基因发生突变而造成功能缺失，会导致骨硬化症(sclerosteosis)、范布凯综合征(VanBuchemdisease)等以颅骨与长骨骨组织广泛过度生长为主要表现的骨硬化病[39,40]。近期研究证实，前交叉韧带横切手术可以诱导SOST基因敲除小鼠产生相较野生型小鼠而言更为严重的膝骨关节炎，提示SOST/sclerostin在骨关节炎早期对该疾病可能具有保护作用[41]。然而，骨细胞中的SOST/sclerostin在骨关节炎发生发展中的作用机制尚未完全明确。此次研究结果显示，骨细胞作为具有传导力学信号功能的细胞，在负荷过重导致的骨关节炎早期改变中，应力刺激相关因子SOST/sclerostin的表达发生明显下调。与此同时，扫描电镜检测结果显示，相同建模时间后，骨细胞的形态出现明显改变，提示SOST/sclerostin的表达水平和骨细胞形态学改变之间可能存在相关性。

此次研究发现小鼠膝关节在骨关节炎初期即出现SOST/sclerostin表达水平的降低，提示骨细胞的力学信号传递功能可能在骨关节炎初期已出现减弱现象；而扫描电镜检测进一步显示，软骨下骨中骨细胞的形态在骨关节炎初期发生明显的变化。正常骨细胞在软骨下骨中排列规律且成一致的梭形，而诱导骨关节炎后4周，软骨下骨中的骨细胞主体部分出现明显形变，形态变圆且不规则，在软骨下骨中的排列不规则。与此同时在扫描电镜下还可观察到，软骨下骨的矿化结构在诱导骨关节炎后4周即出现明显异常，规律的层状沉积方式消失，矿化结构成不规则结节状，且其与软骨组织的交界崎岖不平。

综上所述，骨关节炎早期小鼠软骨下骨的形态学特征主要包括软骨下骨与关节软骨交界处的形态发生不规则变化，伴随软骨下骨骨矿化密度的下降和BV/TV的升高；骨细胞微观形态发生不规则变化，伴随SOST/sclerostin表达水平的下降。上述结论为软骨下骨硬化和骨细胞形态学改变在骨关节炎发生发展中的作用提供了更新、更直观的证据，未来将对软骨下骨及其基质中骨细胞形态改变的具体机制进行进一步探究。

参考文献:

[18]钟京谕,姚伟武.骨关节炎中软骨及软骨下骨间信号交流[J].国际骨科学杂志,2019,40(4):207-210,214.

[24]常亮,秦江辉,史冬泉,等.骨关节炎与软骨下骨研究进展[J].中华骨与关节外科杂志,2019,12(10):827-832.

[25]李强,张柳.骨性关节炎中软骨下骨与软骨退变的关系研究进展[J].中国修复重建外科杂志,2009,23(2):245-248.

[29]邵毅杰,姜华晔,高超,等.膝关节应力负荷减少对小鼠早期骨关节炎软骨和软骨下骨的影响[U].中国组织工程研究;2019,23(35):5611-5618.

文章来源：李婧瑜,苏盈盈,白丁.骨关节炎早期模型小鼠软骨下骨的形态学特征[J].中国组织工程研究,2022,26(11):1692-1698.