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基质金属蛋白酶13在靶向治疗骨关节炎的研究进展

2024-03-11 147 上传者：管理员

摘要：骨关节炎(osteoarthritis, OA)是一类常见的慢性退行性疾病，可导致关节软骨、滑膜、软骨下骨等多组织损伤。目前，该疾病的发病机制尚未完全阐明。研究发现基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)与该疾病的发病过程相关，特别是MMP13,其在机体内的表达水平与OA关系密切。近年来，针对MMP13在该疾病发生发展中的作用，靶向MMP13治疗OA具有诸多进展，选择性MMP13抑制剂较广谱MMPs抑制剂具有选择性强、毒副作用低、效能高等优点，但需要频繁给药以维持药物在体内的有效浓度；将与MMP13 mRNA具有选择性互补的小干扰RNA注射入关节腔可有效降低体内MMP13蛋白产生并抑制多种炎症因子表达，且单次注射可较长时间维持药物效果；利用CRISPR-Cas9基因编辑技术靶向消融MMP13基因以减弱软骨细胞外基质蛋白的降解从而治疗OA的方式在动物体内外模型中均具有较好效果，但该技术在人体内长期应用的安全性也引发人们的思考。靶向MMP13治疗OA是医学界及科研领域的重要研究方向，未来结合更前沿的生物医学技术将为探索治疗OA提供新的策略。

关键词：
MMP13抑制剂
基因编辑
基质金属蛋白酶13
小干扰RNA
骨关节炎
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骨关节炎(osteoarthritis , OA)是世界范围内较为常见的关节退行性疾病，OA所致的关节软骨退变会导致关节软骨间隙狭窄、软骨下骨质破坏及骨赘形成，最终引起关节僵硬、疼痛及活动障碍，严重影响患者生活质量。OA的发病机制复杂，目前仍未得到确切的阐明。近年来，研究者发现某些基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs)特别是MMP13作为介导软骨基质降解的关键酶在OA的发病机制中发挥着重要作用。

1、OA概述

在世界范围内，约有2.4亿人患有有症状的活动受限性OA疾病[1] ,OA发病隐匿，临床上很难发现最早期的OA[2],该疾病侵犯的关节主要包括膝关节、髋关节、远端和近端指间关节、腕掌关节、第一跖趾关节和脊柱小关节[3],其中膝关节和髋关节是OA最常累及的部位。据统计，OA在髋关节的发病率略低于膝关节，在45岁及以上的人群中，有OA临床症状且合并有影像学证据的髋关节及膝关节OA个体分别约占人群的10%和16%[4]。OA的疾病危险因素包括肥胖、性别(女性)、衰老、受伤、炎症反应和高强度运动等[5,6],其常见的临床表现有关节线压痛、被动和主动运动范围缩小、关节腔积液、骨肿胀和畸形，其诊断主要基于患者的临床表现，影像学检查X线片也可作为该疾病的辅助诊断措施，特征性的X线表现有关节间隙变窄、骨赘形成、软骨下硬化和囊肿形成[7]。

临床上针对OA的治疗方式主要包括非侵入性保守治疗及手术治疗。OA保守治疗的目的是改善患者残存的关节活动功能并缓解疾病疼痛，基本方式是指导患者适当运动并适度减重[1],主要方式是药物治疗包括口服及关节腔内给药。非甾体类抗炎药物是治疗OA的常用口服类药物，在缓解疼痛方面具有一定效果，但该类药物不能减缓软骨退化，不能从根本上改善OA所致的骨退行性变，并且长期服用还会导致胃肠道疾病发生[8];另一种方式是采取关节腔内注射某些生物制剂如糖皮质激素、透明质酸、富血小板血浆等以缓解疾病进展[9,10]。近年来，也有研究者将蛋白质、外泌体等通过纳米级递送系统通过关节腔内注射的方式与受损软骨细胞靶向结合以研究治疗该疾病[11],但需要更多的研究来确定这些疗法在OA进展和治疗中的真正益处。随着疾病进展到后期，保守治疗方式往往无法发挥有效作用，患者需要通过行关节置换手术来改善关节活动度，但同时手术治疗也面临着术后静脉血栓栓塞性疾病、关节纤维化和疼痛、术后假体关节感染、假体松动以及随着并发症进展需要进行二次翻修手术等严峻问题[12]。在保守治疗及手术治疗均存在限制的当下，着手于疾病发生发展机制，探索以预防为主、尽可能在疾病早期治疗并延缓病情发展的新方式是医学界的重要研究方向，而MMPs特别是MMP13与OA发生发展密切相关，近年来已得到广泛关注。

2、MMP家族

MMPs, 因这类酶发挥活性时需要含有活性的Zn2+与Ca2+等金属离子结合到催化活性区进而发挥作用[13],故称之为金属蛋白酶，人体中已知的MMP种类高达24种[14]。该类酶有三个结构域，包括前肽结构域、催化结构域及血红素样C端结构域[15]。最初分泌的前体MMP无活性，需要蛋白水解酶去除前肽结构域后使催化Zn2+和结构Zn2+结合到催化结构域与血红素结构域后才能发挥酶活性[16],这一过程称为MMP的激活。研究发现促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α可参与多种MMPs的激活[17]。该类酶被激活后可降解包括原纤维及非原纤维胶原蛋白、层粘连蛋白、基底膜糖蛋白等多种细胞外基质蛋白，并可通过裂解细胞表面受体进一步发挥致病作用[18]。

MMP家族多个成员与OA发生具有相关性[19,20,21]。MMP1主要由位于关节浅层的滑膜细胞分泌，属于MMP家族的胶原酶亚群，能够降解细胞外基质中II型胶原纤维的三维螺旋链[22]。一项meta分析样本源亚组分析发现，OA患者滑膜关节液中MMP1蛋白表达量明显大于对照组，而OA患者与对照组血清中MMP1蛋白表达量无显著性差异[22]。但有研究表明OA发生时，MMP1的表达量即使高于MMP13数倍，其对II型胶原纤维的降解作用仍明显弱于MMP13[23]。MMP3是MMP家族中参与软骨降解的另一类重要的酶，可通过降解细胞外基质并激活影响骨降解过程的其他丝氨酸蛋白酶发挥降解作用[24]。MMP3基因已被证实是OA发病相关基因之一，有研究对女性膝关节OA患者滑液中MMP3基因表达的相关危险因素分析表明年龄、IL-1β、TNF-α与该基因表达存在显著相关性，其具体机制仍需进一步研究[24]。有报道表明位于细胞核中的MMP3有可能作为结缔组织因子的反式转录因子，通过调节结缔组织生长因子参与OA的发生发展，但其具体机制仍需进一步探究。MMP9,又被称作明胶酶B[25],除分解变性胶原外，MMP9还可激活其他MMPs, 包括前体MMP13胶原酶[26],最近一项研究采用生物信息学方法，从数据库中筛选出与OA相关的两个潜在生物标志物——MMP9和COL3A1,并结合实验验证发现在骨软骨细胞中，随着IL-1β浓度的升高，MMP9和 COL3A1的基因和蛋白表达水平也随之升高[25]。此外，MMP9也作为类风湿关节炎及某些癌症如骨巨细胞瘤的潜在生物标志物被广泛研究[26,27]。

MMP13是MMP家族中破坏关节软骨最强的酶，与OA发病非常密切。MMP13通常以前体MMP13胶原酶的形式产生，可被细胞表面的MT1-MMP及MMP9等激活，并在MMP2存在时活性更强[26,28]。该类酶能够通过特定的信号通路及相关调节因子包括内源性抑制剂、转录因子、生长因子等直接或间接地启动多种下游因子导致软骨基质和胶原成分的降解[28]。MMP13的首要作用底物是II型胶原纤维，其裂解II型胶原纤维的速度比裂解I型胶原纤维快5倍，比III型快6倍[26]。MMP13也可通过作用于可聚蛋白多糖进而导致关节软骨破坏，其所导致的病理变化除了软骨侵蚀、溃疡外，还伴有滑膜炎及滑膜增生[29]。此外，MMP13还可作用于其他基质分子诸如I型、III型、IV型、IX型、X型胶原蛋白，纤维蛋白，骨连接蛋白等[26],对加速骨质破坏、促进OA发生发展方面具有极强作用，本文将主要针对MMP13进行详细阐述。

3、OA中MMP13水平及其影响因素

MMP13表达水平与关节软骨结构改变具有相关性，随着OA进展，机体关节软骨磨损程度愈发严重，MMP13表达水平也逐渐升高[30]。Xin等[30]的研究纳入分析33例晚期内翻性OA患者，发现胫骨平台内侧严重磨损软骨的MMP13水平明显高于外侧相对完整软骨的MMP13水平，并且相比于正常人群，OA患者血清MMP13水平升高。此外，OA患者血清MMP13水平与判断OA严重程度的两种评分标准包括WOMAC评分和KL分级评分之间存在显著相关性。也有研究对KL评分标准3级和4级膝关节OA患者血清和滑膜液成分检测后发现，随着病情的进展，滑膜MMP13和血清TNF-α水平明显升高，其中，MMP13通过局部方式升高，且与WOMAC评分相关[31]。此外，黄远等[2]综合检测膝OA 患者及健康人血清、尿液、关节液及关节软骨内MMP13及其他生物标志物含量，发现MMP13等在OA患者血清、尿液、关节液及关节软骨内均呈高表达，且其表达量与WOMAC评分与及K-L分级呈正相关，MMP13对早期诊断OA、判断OA病情严重程度及预测疾病晚期方面具有重要参考价值。

研究发现OA中MMP13过表达还与炎症因子相关，RUAN等[32]发现OA患者血清MMP13的水平可能受炎症因子的调节，TNF-α,IL-8,IL-6和IL-1β均可上调MMP13的表达。ZHAO等[33]检测轻、重度膝关节OA患者及正常人群滑膜组织中MMP13、NF-κBp65、IL-1β mRNA及蛋白的表达，发现OA患者组织中MMP13、NF-κBp65和IL-1β的表达水平均较正常组显著升高，其升高水平与病情严重程度具有相关性，且在OA进展过程中，NF-κB信号通路可能被激活，进而上调MMP13和IL-1β的表达，加速病情恶化。除NF-κB信号通路外，IL-1β、TNF-α和其他多种细胞因子和生长因子也通过特定位点原件的聚合，以依赖于p38、JNK和PKC等信号通路传导的方式反向激活MMP13启动子进而调节MMP13表达[34,35,36]。此外，某些分子如骨膜蛋白[37]、弹性蛋白酶[38]等也会对机体MMP13表达水平产生影响。MMP13水平与关节软骨结构的相关性对判断OA严重程度具有重要参考价值，同时，其与体内炎症因子在多种信号通路中的交互作用也为治疗OA提供了研究思路。

4、靶向MMP13治疗OA研究进展

过去，针对MMPs在OA发生发展中的作用，研发口服生物可利用的广谱MMPs抑制剂是治疗OA的一大研究方向。虽然这些广谱抑制剂表现出高效力，但对MMP家族成员的选择性很差。同时，使用这些广谱MMPs抑制剂的毒性作用较强，表现为严重的肌肉骨骼副作用，包括关节僵硬和肌肉骨骼综合征，严重的毒副作用的存在使MMPs抑制剂的临床试验被迫中止[8,39]。MMP13是导致OA软骨损伤的关键驱动因素，近年来，研究人员将目光聚焦于研发选择性MMP13抑制剂，例如Nara等[40]利用X射线晶体结构叠加将喹唑啉衍生物和三唑衍生物与MMP13催化结构域结合，设计了一类以1,2,4-三唑-3-基为锌结合基团的新型选择性MMP13抑制剂并在生物模型中得到验证；Bendele等[41]报道的一种新的变构MMP13抑制剂——aqua-019,在效价、代谢稳定性和口服生物利用度方面均进行了优化，成为一种潜在的OA治疗药物。但小分子选择性抑制剂通常需要频繁给药以维持药物在体内的有效浓度，并有可能引起肾毒性[8],需要更多研究进行验证。

除了相关抑制剂的研发，也有研究利用与MMP13 mRNA具有选择性互补的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)进一步探索治疗OA的方式。Bedingfield等[8]合成利用靶向针对MMP13的siRNA,并将负载siRNA的纳米颗粒(siNPs)包封在形状确定的微孔板(μPLs)中，形成siNP-μPLs, 将siNPs-μPLs通过小鼠关节内注射到达股胫软骨界面、半月板、髌下脂肪垫和滑膜，使其分散在膝关节内。经过一系列检测发现单次关节内注射siNP-μPLs实现了65% ～75%的MMP13基因敲低，从而减少了MMP13蛋白的产生。同时，MMP13抑制还导致下游一系列与OA病理生理相关的炎症标志物(IL-1β、IL-6和TNFα等)的表达减少。从而保护了小鼠关节软骨完整性，改善了关节整体组织病理学，减少了异位矿化及骨赘的形成。有研究进一步对siRNA最佳的给药时间和频率进行了深入探究，结果显示siRNA在膝关节中的作用持续时间至少为1周。在半月板术后2周时，靶向MMP13的siRNA处理组小鼠体内MMP13 mRNA表达水平较对照组下降40%,因而在手术后2周的高峰时间点抑制MMP13水平对预防OA发展至关重要。此外，研究也证实重复注射MMP13 siRNA对手术诱导的小鼠OA早期软骨退行性变的抑制作用与单次注射相当[42]。siRNA通过与靶基因mRNA的互补碱基配对，可以选择性地抑制药物无法作用的靶标，同时减少脱靶效应，且显示出较低的细胞毒性，单次注射靶向MMP13的siRNA已被证明在体外及动物模型体内都可有效降低蛋白酶作用[42],未来在治疗OA领域具有潜在的应用价值。

此外，研究人员还利用CRISPR-Cas9基因编辑技术不断探索靶向抑制MMP13基因在OA中的作用。CRISPR-Cas9基因编辑技术是可高效、精确、程序化修改基因组的工具，ZHAO等[43]利用该技术靶向消融MMP13基因从而使小鼠体内软骨降解酶的表达降低，软骨损伤进展变缓，该项研究也证明联合消融MMP13和IL-1β等基因对疼痛管理和关节结构维持具有综合效用。Liang等[44]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了一种软骨细胞特异性关节腔内递送质粒，该质粒基于外泌体和脂质体融合衍生出的杂交外泌体靶向敲除MMP13基因以治疗大鼠OA,结果显示应用该技术构建的质粒可有效降低软骨细胞中MMP13的表达，进而减弱软骨细胞外基质蛋白的降解，抑制软骨细胞中MMP13表达治疗OA的策略在体外和体内模型中均有显著的效果。尽管基因组编辑在患者中的长期安全性(包括质粒DNA和Cas9蛋白的免疫原性以及基因编辑的潜在脱靶性)有待进一步探索[44],但CRISPR基因组编辑技术正处于临床应用的开端，未来结合细胞外囊泡、外泌体及其他前沿研究构建更安全、有效的载体将CRISPR/Cas9系统精确地传递到与疾病相关的细胞和生物体中为治疗包括OA在内多种疾病具有更广阔的发展前景。

参考文献:

[2]黄远,刘日光,张沕,等.膝关节骨关节炎相关炎症及软骨代谢标志物的表达与临床意义[J].中国骨质疏松杂志,2021,27(11):1614-1619,1625.

[13]谢晔,万琪,慕静然,等.基质金属蛋白酶参与神经病理性疼痛的研究进展[J].中国病理生理杂志,2023,39(2):379-384.

[29]罗媚,杜信眉,周学东.基质金属蛋白酶与骨关节炎发生发展关系的研究进展[J].四川大学学报(医学版),2023,54(1):77-82.

基金资助:国家自然科学基金(81860401);内蒙古自治区科技厅重点项目(2022YFSH0075);内蒙古自治区公立医院高水平临床专科发展科技项目(2023SGG2143);

文章来源:赵连兴,杜欣瑞,王国强等.基质金属蛋白酶13在靶向治疗骨关节炎的研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2024,30(03):413-417.