痛风已成为全球高发疾病，并呈现年轻化趋势[1,2]。急性痛风性关节炎（acute gout arthritis,AGA）是一种自身炎症性疾病，其特征是高尿酸血症和单尿酸钠（monosodium urate,MSU）晶体在关节和组织中沉积，发作时关节局部会出现严重的红肿热痛。如果长期不治疗，痛风可能会引发心血管疾病和肾功能受损[2,3]。目前对AGA的治疗缺乏安全有效的药物，因此有必要深入研究AGA的发病机制。细胞焦亡是一种新型的炎性细胞死亡形式，其核心是由模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR）、衔接蛋白和胱天蛋白酶-1(Caspase-1）组成的炎症小体。痛风作为一种自身炎症性疾病，该病患者的机体可通过内源性损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns,DAMPs）和外源性病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）来识别MSU，从而激活固有免疫细胞内的炎症小体，参与免疫应答[4]。目前，临床上已发现了10余种炎症小体。其中，黑素瘤缺乏因子2(AIM2）炎症小体属于PHYIN蛋白家族，它在单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞中表达，并参与炎症反应、调节细胞焦亡。AIM2是细胞内唯一能识别胞浆双链DNA(double-stranded DNA,ds DNA）的炎症小体[4]。研究发现，AIM2参与系统性红斑狼疮（SLE)[5]、类风湿关节炎（RA)[6]和干燥综合征[7]等多种自身免疫性疾病的发病过程。然而，关于AIM2炎症小体在AGA方面的作用鲜见报道。本研究通过检测AGA患者和健康对照者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中AIM2炎症小体介导的细胞焦亡相关分子以及血清炎性因子白细胞介素（interleukin,IL)-1β、IL-18的表达，探究AIM2炎症小体介导的细胞焦亡途径在AGA发病中的作用，为痛风治疗提供参考。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取2022年1月—6月于中国人民解放军北部战区总医院就诊的AGA患者（AGA组）30例，均为男性，平均年龄（34.83±11.19）岁，平均体质量指数（BMI）为（28.17±2.93)kg/m2。AGA诊断根据1977年美国风湿病学会制定的痛风分类标准、2015年美国风湿病学会和欧洲抗风湿病联盟共同制定的痛风分类标准。纳入标准：年龄18～70岁；入院前1个月内未使用过治疗痛风性关节炎的药物；精神状态良好，能够理解研究内容并接受相应处理。排除标准：伴感染性关节炎、创伤性关节炎、结缔组织病或其他晶体相关性疾病者；继发性痛风者；存在心脑血管疾病者；存在出血系统病变或肿瘤者。另选30例男性健康查体者为对照（HC）组，年龄34.50(28.75,46.50）岁。2组年龄差异无统计学意义（Z=1.191,P>0.05）。本研究已经获得北部战区总医院伦理委员会的批准[伦审Y(2021)148]号。

1.2主要仪器与试剂

Quant-i T™Pico Green®ds DNA Assay Kit购自美国Invitrogen公司；人外周血淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；蛋白提取试剂盒购自中国爱必信（上海）生物科技有限公司；IL-1β和IL-18酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒购自中国江苏酶免实业有限公司；Anti-AIM2抗体购自中国爱必信（上海）生物科技有限公司；Anti-Caspase-1、Anti-IL-1β、Anti-IL-18抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司；Anti-GSDMD抗体购自中国博奥森公司；Anti-GAPDH抗体、HRP标记的山羊抗兔Ig G购自中国武汉赛维尔生物科技有限公司；一步法PAGE凝胶快速制备试剂盒购自中国上海雅酶生物医药科技有限公司；Bio Tek Synergy2多功能酶标仪购自美国Bio Tek公司；Rayto RT-6100酶标分析仪购自美国Rayto公司；Nano Drop 2000分光光度计、电泳仪购自美国BIO-RAD公司；GE AI 680超灵敏多功能成像仪购自美国Cytiva公司。

1.3研究方法

1.3.1血常规和生化指标检测

收集受试者外周静脉血8 m L，血细胞分析仪检测血清白细胞计数（WBC）、血红蛋白（Hb）、血小板计数（PLT），自动生化分析仪检测空腹血糖（FBG）、血尿酸（UA）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、肌酐清除率（Ccr）、红细胞沉降率（ESR）和C-反应蛋白（CRP）水平。

1.3.2荧光定量法检测血清ds DNA水平

96孔板内每孔加入90µL TE缓冲液后加入10µL血清，每孔再加入100µL用TE缓冲液稀释200倍后的Pico Green稀释液，常温避光孵育10 min,Bio Tek Synergy2多功能酶标仪于激发光480 nm、发射光520 nm波长条件下检测并计算ds DNA浓度。

1.3.3 Western blot法检测AIM2、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18蛋白相对表达水平

取外周静脉血并加入肝素抗凝，于离心机1 500 r/min离心10 min，用尖头吸管吸取白膜状细胞层，加入聚蔗糖—泛影葡胺分层液，离心弃上清并重复操作2次，加入RPMI-1640培养液，4℃保存备用。加入Western/IP裂解液裂解不同组别的PBMCs,BCA定量法进行蛋白浓度测定，并以最低蛋白浓度进行调整，根据蛋白分子质量大小选择6%、10%的SDS-PAGE凝胶进行电泳。分离蛋白质后转移到0.45µm PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温摇床封闭2 h，用1×TBST洗膜，5 min/次×3次，于4℃摇床分别过夜孵育AIM2(1∶500）、Caspase-1(1∶1 000）、GSDMD(1∶500）、IL-1β(1∶1 000）、IL-18(1∶1 000）和GAPDH(1∶2 000）抗体；1×TBST充分洗涤后，用HRP标记的山羊抗兔Ig G抗体室温摇床孵育2 h，通过ECL化学发光试剂盒显影，GE AI 680超灵敏多功能成像仪获取条带图像，Image J软件分析条带灰度值并计算相对表达水平。

1.3.4 ELISA检测血清炎性因子水平

参照ELISA试剂盒说明书，Rayto RT-6100酶标分析仪在450 nm波长处测量受试者外周血血清的光密度（OD）值，计算IL-1β和IL-18水平。1.4统计学方法采用SPSS 23.0和Graph Pad Prism 9.0软件进行数据分析。符合正态分布的计量数据用表示，2组间比较用t检验，非正态分布的以M(P25,P75）表示，组间比较用秩和检验。相关分析用Pearson或Spearman相关。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 2组血常规和生化指标比较

2组Hb、FBG、ALT和AST比较差异无统计学意义。与HC组比较，AGA组WBC、PLT、ESR、CRP、UA、TC、TG、Scr和Ccr水平增加（P<0.05），见表1。

2.2 2组受试者血清中ds DNA水平比较

AGA组血清ds DNA水平[56.12(50.70,61.83)mg/L]高于HC组[44.09(40.61,48.28)mg/L]，差异有统计学意义（Z=4.487,P<0.01）。

2.3 2组PBMCs中相关蛋白表达水平比较

与HC组比较，AGA组PBMCs中AIM2、Caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18的蛋白相对表达水平均增加（P<0.01），见图1、表2。

2.4 2组血清中IL-1β、IL-18表达水平比较

AGA组血清IL-1β、IL-18水平高于HC组（P<0.01），见表3。

2.5 AIM2炎症小体成分之间的相关性分析

在PBMCs中，AIM2蛋白的表达水平与Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18蛋白表达水平均呈正相关（r或rs分别为0.965、0.986、0.928及0.737，均P<0.01）。

3、讨论

AGA的发病是一个复杂的“代谢-免疫-炎症”网络调节过程，其中不同的炎症因子相互作用，导致疾病的发生和发展[8]。在正常生理情况下，关节腔内没有或只有少量中性粒细胞，AGA时大量中性粒细胞被招募到晶体沉积部位。这些中性粒细胞不仅会吞噬MSU晶体，还会释放IL-1β和IL-18等炎症介质，从而引发局部急性炎症反应。此外，活化的IL-1β还会吸引中性粒细胞释放大量由DNA、组蛋白和中性粒细胞颗粒等成分组成的中性粒细胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps,NETs）。中小剂量的NETs以核内或线粒体内DNA为骨架，并负载水解酶形成网状结构。这些NETs包裹及消灭MSU晶体，抑制炎症反应，从而缓解痛风发作，但如果NETs过度形成或未能及时清除，释放的DAMPs会刺激固有免疫系统的活化，引发炎症反应[9]。在痛风患者的关节滑液中，可以观察到染色的ds DNA[10]。本研究结果显示，AGA组患者血清中ds DNA水平显著升高。因此，识别和清除ds DNA片段可能成为AGA研究的新靶点。

图1 Western blot检测2组患者AIM2、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18蛋白水平   

表1 2组受试者的实验室指标比较    

表2 2组AIM2、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和IL-18蛋白表达水平比较   

表3 2组血清IL-1β和IL-18的表达水平比较  

当AIM2炎症小体受到ds DNA刺激时，激活Caspase-1会生成和释放IL-1β和IL-18，并通过剪切GSDMD诱导细胞焦亡[4,11]。在固有免疫中，轻中度的细胞焦亡可清除机体内的危险因子，发挥保护作用。然而，高水平的细胞焦亡会导致细胞过度死亡，从而引起机体损伤[12]。既往研究发现，干燥综合征患者的导管组织中和非肿瘤性导管唾液腺上皮细胞系的DNase1表达和活性受损，导致ds DNA降解缺陷，引发上皮细胞AIM2的持续性激活[7]。SLE患者外周血中的ds DNA水平和PBMCs中AIM2 m RNA表达水平明显增高，并且其水平与肾脏受累和疾病活动度相关[13]。在小鼠SLE模型中，抑制AIM2的表达可以显著减轻SLE症状[5]。在RA患者的外周血PBMCs和中性粒细胞中，AIM2炎症小体的表达上调，并与其下游的靶基因ASC、Caspase-1及病情严重程度相关[6]。本研究发现，在AGA患者的PBMCs中，AIM2蛋白的表达水平明显增加，提示在AGA的发生发展过程中机体可能会产生大量ds DNA，从而激活AIM2的表达。

Caspase-1是经典细胞焦亡途径中炎症小体复合物的重要组分。当它被激活后，不仅会裂解proIL-1β和pro-IL-18，生成成熟的促炎因子IL-1β和IL-18，还会裂解GSDMD[14]。既往研究表明，在AGA患者的PBMCs和AGA大鼠模型的关节滑膜中，Caspase-1蛋白的表达水平均明显增加[14]。本研究结果亦显示，AGA患者的PBMCs中Caspase-1蛋白水平升高，并且该水平与AIM2蛋白水平呈正相关，提示Caspase-1的表达可能与AIM2炎症小体的激活有关，共同参与了AGA的发生过程。

GSDMD是细胞焦亡的最终效应执行者。在Caspase-1的作用下，GSDMD-N从GSDMD-C的抑制状态中释放出来，在细胞膜上形成直径为10～20 nm的孔道，导致细胞内物质外流，水逆渗透压内流，最终导致细胞膜破裂和细胞焦亡发生[11,15]。本研究结果显示，AGA患者GSDMD蛋白的表达水平显著增加。既往研究也有类似的结果，但是其中一些报道认为GSDMD表达水平增加是由NLR家族的另一个成员NLRP3炎症小体介导[8,16,17]。本研究发现，GSDMD蛋白的表达水平与AIM2和Caspase-1蛋白的表达水平均呈正相关，提示GSDMD可能参与了AIM2炎症小体介导的细胞焦亡。

IL-1β和IL-18是IL-1家族中常见的促炎因子。IL-1β主要由活化的巨噬细胞分泌，通过与IL-1β受体结合触发下游促炎细胞因子和趋化因子的级联信号，从而招募中性粒细胞和其他细胞到晶体沉积处，引发和加重局部炎症反应。IL-18存在于健康人体血液的单核细胞以及胃肠道的上皮细胞中，其分泌主要与Caspase-1有关，在炎症和免疫调节中发挥重要作用。既往研究发现，痛风患者的血清和鼠模型滑膜中尿酸水平与IL-1β及IL-18的水平呈正相关，而IL-1β阻断剂可以显著改善痛风症状[18,19,20]。本研究亦发现，AGA患者的PBMCs血清中IL-1β及IL-18浓度显著提高，并且PBMCs中AIM2蛋白的表达水平与IL-1β和IL-18表达呈正相关。

综上，AIM2炎症小体介导的细胞焦亡在AGA发生、发展中发挥重要作用，可能为AGA治疗药物的新靶点。然而，由于本研究样本量少、单中心以及可能存在选择偏倚等因素，AIM2炎症小体介导的细胞焦亡通路在AGA中的具体作用仍需要进一步探索。

参考文献:

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基金资助:辽宁省自然科学基金项目(2019-MS-350);联勤保障部队重点项目(19LBJ1003B);

文章来源:初吉燕,田竞,付笛语,等.AIM2炎症小体在急性痛风性关节炎中的表达及意义[J].天津医药,2024,52(05):518-522.