宫颈癌是全球范围内危害较严重的恶性肿瘤之一，发病率位于女性恶性肿瘤中第2位，85%以上患者来自中低收入的发展中国家[1,2]。中国每年宫颈癌的发病率占全球1/4以上，45岁以上人群的宫颈癌新发病例约7万，占总数的70%，且近年其发病呈逐渐年轻化趋势，给全球女性健康造成严重伤害[3,4]。微小RNA(miRNA）是一种内源性非编码单链小分子的RNA，其长度约为18～25个核苷酸，可与mRNA3'端非编码区（3'UTR）结合，调节基因表达，参与个体发育、细胞增殖、凋亡和分化等生命活动过程[5,6]。研究显示，miR-196b作为其中一种miRNA在宫颈癌组织中表达上调，可能参与调控宫颈癌疾病的发生发展过程[7]，但是有关miR-196b对宫颈癌细胞顺铂耐药影响的研究目前尚未见相关报道。本研究通过下调HeLa/DDP细胞中miR-196b基因的表达，观察下调miR-196b表达对宫颈癌细胞顺铂耐药的影响，初步探讨miR-196b在宫颈癌细胞顺铂耐药中的作用机制，为后期相关研究提供一定参考。

1、材料与方法

1.1 材料

人宫颈癌细胞株HeLa、顺铂耐药细胞株HeLa/DDP（货号分别为XB-0620、XB-0643）购自上海奥陆生物科技有限公司；miR-196binhibitor、negativecontrol(NC）（货号分别为：hsa-mir-196b、miR03101）购自百奥迈克生物技术有限公司；化疗药顺铂（货号：15663-27-1，纯度：Pt≥98%）购自宝鸡市国康生物科技有限公司；LipofectaminTM2000（货号为：rs374987523）购自美国Invitrogen公司；鼠抗人蛋白激酶B(proteinkinaseB,Akt）、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylaseBkinase,p-Akt）、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3-kinase,PI3K）、磷酸化雷帕霉素靶蛋白（phosphorylatedmammaliantargetofrapamycin,p-mTOR）单克隆抗体（批号分别为：RAB1911、RAB1916、RAB1908、RAB1923、RAB1928）购自美国Sigma公司；PVDF膜、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗（货号分别为：F619537、D110098）购自上海生工生物工程有限公司；蛋白提取试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒（货号分别为：C510003、C503021）购自美国Thermo公司；RNA提取试剂盒（货号：DP419）购自北京天根生化有限公司；AceQqPCRSYBR®GreenMix（货号：Q111-02）购自南京vazyme生物公司；蛋白凝胶成像仪（型号：GelDocXR+）购自Bio-Red公司；qRT-PCR仪购自美国BioRad公司；本研究引物由西安擎科生物公司合成等。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组及转染

收集对数生长期HeLa/DDP、HeLa细胞，在培养基中分别加入终浓度为0.01、0.1、1、5、10、20、40、80、100μmol/L顺铂药物，培养48h,MTT法检测HeLa/DDP、HeLa细胞的IC50，每组设6个复孔，筛选最佳顺铂浓度。培养对数生长期HeLa/DDP细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，接种于6孔细胞板（1×106个/孔），待细胞融合度达80%时，更换为无血清DMEM培养基，采用Lipo‐fectamineTM2000法进行转染，转染后用无血清DMEM培养基继续培养24h，将终浓度为5μmol/L顺铂加入HeLa/DDP细胞中，继续培养48h。将HeLa/DDP细胞根据转染试剂的不同分为3组，空白对照（仅用转染试剂处理）+DDP，阴性对照（转染NC)+DDP组，miR-196binhibitor（转染miR-196binhibitor)+DDP组，转染操作步骤严格按照LipofectaminTM2000试剂盒说明书进行，转染后培养箱继续培养。

1.2.2 MTT法检测细胞IC50

收集1.2.1中的各组细胞，用MTT检测法检测各组细胞的IC50，将细胞用胰酶消化后制成单细胞悬液，按2×104个/孔的细胞密度铺于96孔板，每组细胞培养液中分别加入顺铂至终浓度0.01、0.1、1、5、10、20、40、80、100μmol/L，每组设6个复孔，培养48h后每孔加20μlMTT(5mg/ml),37℃避光孵育4h，弃上清，加DMSO(150μl/孔）充分振荡使结晶溶解。酶标仪测定490nm波长处的吸光度值，6个复孔取平均值。实验重复6次，应用统计软件绘制细胞存活率曲线并求出IC50。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率

收集1.2.1转染后的各组细胞，用胰蛋白酶消化，预冷PBS洗涤2次，离心弃上清，配制成1×106个/ml的细胞悬液，100μl细胞悬液加入5μlAnnexinV‐FITC和5μlPI混匀，室温避光孵育15min，流式细胞仪检测凋亡率。实验重复6次。

1.2.4 实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCR,qRT-PCR）检测各组细胞miR-196b表达水平

RNA提取试剂盒提取1.2.1中各组细胞的总RNA，经反转录得cDNA。采用定量PCR仪对miR-196b基因进行PCR扩增。qRT-PCR反应体系共10μl:miS‐criptSYBR®GreenMix5μl,cDNA(50ng/μl)1μl，上下游引物（10μmol/L）各0.5μl,ddH2O3.0μl。反应条件：95℃，90s;95℃，30s;63℃，30s;72℃，15s;40个循环。miR-196b及其内参U6引物序列见表1。采用2-∆∆Ct法对miR-196b表达水平进行定量分析。

1.2.5 Westernblot检测各组细胞Akt、p-Akt、PI3K、p-mTOR蛋白表达按照蛋白提取试剂盒说明书提取1.2.1各组细胞中总蛋白，采用BCA蛋白试剂盒对细胞中总蛋白含量进行测定。采用SDS-PAGE分离等量蛋白质，将蛋白质转PVDF膜上，置于4℃下添加Akt、p-Akt、PI3K、p-mTOR一抗及β-actin一抗（1∶500），孵育过夜。洗涤后添加辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5000）常温孵育2h。采用Tanon600图像分析系统对蛋白水平Akt、p-Akt、PI3K、p-mTOR进行定量分析。

1.3 统计学分析

本研究所得数据均采用SPSS22.0软件进行统计，计数资料以n（%）表示；计量资料用表示，行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 miR-196b在HeLa/DDP、HeLa细胞中表达水平比较

与HeLa细胞miR-196b表达水平（0.96±0.21）相比，HeLa/DDP细胞中miR-196b表达水平（1.58±0.25）显著升高（t=4.651,P<0.05）。

2.2 检测HeLa/DDP、HeLa对顺铂的敏感性

随顺铂浓度增加（0.01、0.1、1、5、10、20、40、80、100μmol/L)HeLa/DDP、HeLa细胞活力下降，经计算HeLa的IC50为4.86μmol/L,HeLa/DDP的IC50为68.13μmol/L，与HeLa对顺铂的IC50[(4.86±1.12）μmol/L]相比，HeLa/DDP对顺铂的IC50[(68.13±7.01）μmol/L]显著升高（t=21.831,P<0.05）。

2.3 下调miR-196b对HeLa/DDP细胞中miR-196b表达的影响

与空白对照+DDP组、阴性对照+DDP组相比，转染后24h、48h,miR-196binhibitor-1+DDP组、miR-196binhibitor-2+DDP组、miR-196bin‐hibitor-3+DDP组、miR-196binhibitor-4+DDP组细胞中miR-196b表达水平均明显减少（P<0.05），其中以转染48h后，miR-196binhibitor-2+DDP组细胞中miR-196b表达水平最低（P<0.05），因此选miR-196binhibitor-2+DDP组转染后48h进行后续研究。见表2。

2.4 下调miR-196b对HeLa/DDP细胞IC50的影响

与空白对照+DDP组、阴性对照+DDP组相比，miR-196binhibitor-2+DDP组细胞IC50显著降低（P<0.05）。见表3。

2.5 下调miR-196b对HeLa/DDP细胞凋亡的影响

与空白对照+DDP组、阴性对照+DDP组相比，miR-196binhibitor-2+DDP组细胞凋亡率显著增加（P<0.05）。见图1、表4。

2.6 下调miR-196b对HeLa/DDP细胞Akt、p-Akt、PI3K、p-mTOR蛋白表达的影响

与空白对照+DDP组、阴性对照+DDP组相比，miR-196binhibitor-2+DDP组细胞p-Akt、PI3K、p-mTOR蛋白表达水平均明显降低（P<0.05),Akt蛋白水平差异无统计学意义。见表5、图2。

3、讨论

宫颈癌是女性生殖系统发病率最高的恶性肿瘤[8]。近年来随着我国人口老龄化进程的加剧以及生活环境、饮食习惯的转变，宫颈癌发病率呈逐渐上升趋势，已成为影响中老年女性人群身心健康和生活质量的主要肿瘤疾病[9]。目前宫颈癌治疗方案主要为手术辅助铂类药物化疗及同步放化疗，其中铂类抗癌药物作为术前或术后的辅助治疗，一定程度上对患者预后具有改善作用，在宫颈癌的治疗中占有重要位置[10]。但部分患者在化疗时，会产生顺铂耐药从而影响疗效导致高病死率[11]，因此积极研究探索宫颈癌顺铂耐药的机制，提高宫颈癌细胞对顺铂化疗药物的敏感性，成为目前医学研究重点。本研究探讨下调HeLa/DDP细胞中miR-196b表达对宫颈癌细胞顺铂耐药的影响，并分析其作用机制。

miRNA是一类起始于细胞核，成熟于细胞质的非编码单链RNA分子，广泛存在于真核细胞中，在哺乳动物中成熟miRNA可对体内60%左右基因进行调节[12,13]。研究表明，人类基因中有2%～3%的miRNA参与体内30%左右的基因调控，miRNA在人体所有组织及血液、尿液、唾液、脑脊液等体液中均可表达[14]。研究发现，miRNA具有癌基因与抑癌基因的双重作用，其可能参与肿瘤的发生、发展过程[15]。研究者通过对宫颈癌组织标本进行miRNA表达谱分析，发现70个miRNA表达明显异常，其中68个miRNA表达显著上调，而miR-149、miR-203表达明显下调，表明miRNA在宫颈癌发生、发展中具有一定作用[16,17]。余昆等[18]研究发现通过下调miR-196b-5p表达促进直肠癌细胞的增殖。ZHU等[19]研究表明miR-196b-5p通过下调COL1A1可抑制乳腺癌细胞的生长和转移。LI等[20]报道，miR-196b在肺癌组织和细胞中高表达，miR-196b可以通过下调GATA6增强肺癌细胞的迁移和侵袭。以上研究提示，miR-196b可能参与调控多种癌症的发生发展过程。miR-196b作为一种miRNA分子，在宫颈癌的发生发展中也起着重要作用[21]，但是有关miR-196b与宫颈癌关系的研究报道较少。

本研究结果显示，与HeLa细胞相比，HeLa/DDP细胞miR-196b表达显著升高，表明miR-196b在耐药宫颈癌细胞中表达上调，miR-196b可能在一定水平上促进细胞耐药；随顺铂浓度增加HeLa/DDP、HeLa细胞活力下降，经计算HeLa对顺铂的IC50为4.86μmol/L,HeLa/DDP对顺铂的IC50为68.13μmol/L，与HeLa相比，HeLa/DDP对顺铂的IC50显著升高，提示HeLa/DDP对顺铂的耐药性远大于HeLa；与空白对照+DDP组、阴性对照+DDP组相比，转染后24h、48h,miR-196binhibitor-2+DDP组细胞中miR-196b表达水平均明显减少，表明下调基因miR-196b顺铂耐药宫颈癌细胞株构建成功，其中以转染48h后miR-196binhibitor-2+DDP组细胞中miR-196b表达水平最低，因此选miR-196binhibitor-2+DDP组转染后48h进行后续研究。本研究通过利用构建好的miR-196binhibitor-2细胞，探索miR-196b基因的下调对HeLa/DDP细胞对顺铂耐药性的影响，结果显示，与空白对照+DDP组、阴性对照+DDP组相比，miR-196binhibitor-2+DDP组细胞IC50显著降低，细胞凋亡率显著增加，表明下调miR-196b可增加HeLa/DDP细胞对顺铂的敏感性，降低其耐药性，促进细胞凋亡。

PI3K属于机体细胞内重要磷脂酰肌醇激酶之一，由1个催化亚基和1个调节亚基组成，可作为关键信号分子参与机体多种生理活动[22]。Akt则为PI3K下游直接靶蛋白，属于一种原癌基因c-Akt过表达产物，当PI3K被激活后，促进AKT发生磷酸化，活化的Akt可进一步促进其下游多种酶和转录因子发生磷酸化作用，进而调节细胞功能。研究表明，PI3K/Akt通路可调控多种细胞生理信息传导，参与机体内各种生命活动[23]。多项研究表明PI3K/Akt信号通路与宫颈癌疾病进展具有重要关系，BAHRAMI等[24]表明PI3K/Akt/mTOR信号通路在宫颈癌预后评估中具有重要价值；HUANG等[25]报道基因FOXC1可通过PI3K-AKT信号通路促进宫颈癌的细胞增殖和上皮间质转化；DONG等[26]发现依维莫司和紫杉醇可通过靶向PI3K/AKT/mTOR途径诱导宫颈癌细胞的凋亡，提示PI3K/Akt信号通路可能参与调控宫颈癌的发生发展过程，但是其与宫颈癌细胞顺铂耐药性的关系目前尚不清楚。本研究结果显示，与空白对照+DDP组、阴性对照+DDP组相比，miR-196binhibitor-2+DDP组细胞p-Akt、PI3K、pmTOR蛋白表达水平均明显减少，Akt蛋白水平差异无统计学意义，表明下调基因miR-196b可抑制Akt、mTOR蛋白磷酸化，抑制PI3K/Akt信号通路的激活，推测下调基因miR-196b可能通过抑制PI3K/Akt信号通路相关蛋白的表达，进而增加HeLa/DDP细胞对顺铂的敏感性，降低其耐药性，促进宫颈癌细胞凋亡。

综上所述，下调基因miR-196b可增加HeLa/DDP细胞对顺铂的敏感性，降低其耐药性，可能通过抑制PI3K/Akt信号通路活化，进而诱导细胞凋亡，为逆转宫颈癌细胞化疗耐药性及基因靶向治疗提供了新思路，但本研究未对miR-196b具体通过靶向哪些基因进而调控PI3K通路进行深入分析，且miR-196b在体内与宫颈癌细胞顺铂耐药的关系尚不清楚，有待进一步深入探讨。

参考文献:

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文章来源：张玉清,邢惠海,刘立秋,王敬,徐书方.miR-196b调控PI3K/Akt通路对宫颈癌细胞顺铂耐药的影响研究[J].中国免疫学杂志,2021,37(23):2865-2870.