宫颈癌是妇科常见恶性肿瘤，主要是由于人乳头瘤病毒(HPV)持续性感染所致[1]。近年来，由于我国人们生活方式开放，宫颈癌的发病率显著增高，且发病人群趋向于年轻人[2]。据调查[3]显示，我国每年新增的宫颈癌患者多达10万/年，在全球宫颈癌病例中占33%,严重威胁到了女性身体健康，现已成为全球高度关注的公共卫生问题之一。宫颈上皮内瘤病变(CIN)发展至宫颈癌是一个漫长的过程，及早发现、及早治疗是降低死亡率、改善预后的关键[4]。大部分CIN会消失，但也有很少部分CIN患者发展成为宫颈癌[5]。高危型HPV基因整合是导致CIN进展为宫颈癌的关键因素[6]。在宫颈癌病变过程中，宿主基因往往会发生HPV整合，而HPV整合往往发生于高级别病变中，意味着HPV基因整合是CIN的晚期结局[7]。基于此，为探讨HPV基因整合在宫颈癌早期诊治中的临床价值，本研究对丽水市妇幼保健院2019年12月—2021年12月接诊的100例宫颈病变筛查患者进行分析，现将结果报道如下。

1、资料与方法

1.1资料来源

选取2019年12月—2021年12月丽水市妇幼保健院接诊的100例宫颈病变筛查患者为研究对象，本研究已获医院伦理委员会审批，年龄27～60岁，平均年龄(43.52±5.34)岁；孕次在3～6次，平均孕次(4.52±1.34)次；产次在0～4次，平均产次(2.52±0.67)次；体质量指数(BMI)19～30 kg/m2,平均BMI(24.52±2.94)kg/m2。纳入标准：①均符合《宫颈癌及癌前病变规范化诊疗指南(试行)》[8]中对宫颈癌及癌前病变诊断标准。②年龄>20周岁。③均有性生活史。④检查前3 d没有进行阴道冲洗、用药，检查前24 h没有性行为。⑤对答切题、意识清醒。⑥均存在不同程度腹痛、阴道出血及白带增多等症状。⑥均知情本研究目的，自愿参与，并已在同意书上签字。排除标准：①既往存在子宫切除史、宫颈手术史及盆腔放射治疗史者。②妊娠、哺乳期女性。③合并自身免疫性疾病者。④同期参与其他研究者。⑤中途退出者。⑥合并骨折、脑梗死等疾病者。⑦重大脏器衰竭、功能障碍者。⑧合并痴呆、抑郁症者。

1.2方法

1.2.1检测方法

HPV检测：在宫颈部位以HPV专用取样刷采取相关标本，宫颈刷紧贴患者宫颈口黏膜以顺时针的方向轻微转动宫颈刷6～7圈，将宫颈刷保存在专用的细胞保存液中，在4℃的温度下保存，用于制备液基宫颈载玻片，将装有细胞悬液的小瓶在30 min内运送至实验室，提取保存液中的HPV之后，高危型HPV用Cerv-ista法检测，分为E5、E6及E7,最终多个或者单个型组的结果为阳性的，即可考虑为HPV阳性。全基因组测序、高通量HPV整合检测：取样品2μg,补充体积至100μl,以microTube管(6 mm×16 mm),在Covaris S2上打断样品，保证打断后主带介于200 bp～300 bp之间。每组样品单独建立文库，将打断的产物3'端以及5'端修复呈平末端，3'端重新加“A”,将末端带有“T”的碱基特殊接头连入产物两端，进行PCR,10个循环，将8 bp index序列，加入至目的片段，纯化磁珠后，完成制备文库工作，将建好的文库以Agilent 2100检测，如果片段主峰在280 bp～500 bp,则文库合格。每个样品文库取500 ng,一个总文库由不同的6个文库Pooling组成，每一个总文库均与GenCap Reagent Kit试剂杂交反应22 h。完成杂交后，富集洗脱，通过15个cycle PCR扩增，增加文库量。杂交后进行质量控制，纯化上一步PCR产物，以ABI7500、Agilent 2100检测文库质量，文库大小在280 bp～500 bp,浓度应符合hiseq 2000的测序要求，在I11umina Hiseq 2000测序仪测序SBS,严格遵循相关标准完成上机、下机操作。测得的序列应将载体序列除去，将载体部分序列插入后作对比，在NCBI-Map Viewer中查询整合体中对比所得的人基因组序列，了解整合区域基因分布情况。所有受检者HPV检测、全基因组测序、高通量HPV整合检测均由具有相关资格证书、受过专业培训的2名医生共同完成，并给出诊断结果，对于存在异议的地方，应再次讨论或介入第3名医生参与讨论，给出最终诊断。

1.2.2观察指标

将宫颈病理检测结果作为本次研究的金标准，统计HPV检测的准确率、灵敏度及特异度。准确率：(真阴性+真阳性)/(真阴性+假阴性+真阳性+假阳性)×100.00%。灵敏度：真阳性/(假阴性+真阳性)×100.00%。特异度：真阴性/(假阳性+真阴性)×100.00%。检测HPV整合类型及位点信息。

1.3统计学分析

采用SPSS 26.0统计学软件对数据进行统计分析，计数资料(HPV基因整合率)采用Pearsonχ2检验，频数<5,以校正χ2检验为主，表示形式为[例(%)],P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

2.1 HPV检测准确率、灵敏度及特异度

宫颈病理诊断93例宫颈癌，7例CIN,HPV检测诊断85例宫颈癌，15例CIN,HPV检测准确率90.00%,特异度71.43%,灵敏度91.40%。

2.2 CIN及宫颈癌HPV整合率

100例患者经HPV检测，3例CIN1、5例CIN2、5例CIN3及87例宫颈癌。其中29例检测到HPV整合，HPV整合率CIN1 33.33%、CIN2 40.00%、CIN3 80.00%、宫颈癌25.29%,差异有统计学意义(χ2=1 163.244,P<0.05)。见表1。

2.3 CIN及宫颈癌整合HPV基因分布

HPV类型包括HPV82、HPV73、HPV68、HPV59、HPV58、HPV56、HPV52、HPV51、HPV45、HPV39、HPV35、HPV33、HPV31、HPV18及HPV16。CIN及宫颈癌整合HPV基因分布见表2。

表1 CIN及宫颈癌HPV整合率

表2 CIN及宫颈癌整合HPV基因分布

3、讨 论

HPV是一种嗜皮肤、黏膜的双链闭合环状DNA病毒，属于乳头状病毒科[8]。世界卫生组织(WHO)调查显示：宫颈癌发病率在女性恶性肿瘤中仅次于乳腺癌[9]。临床有大量研究[10,11]证实，HPV感染是引发宫颈癌的重要原因，将近99%的宫颈癌患者HPV检测结果时阳性。目前，HPV的数量、类型已成为临床诊断宫颈癌、癌前病变的重要指标[12,13]。有学者[14]认为，HPV在宫颈良性病变、癌前病变中普遍以游离形态存在，而在宫颈癌中以整合形式存在，HPV整合会促进宫颈上皮细胞繁殖。从CIN发展至宫颈癌进程缓慢，因此，及早对CIN做出准确的诊断，有助于临床给予针对性治疗，降低宫颈癌发生风险。当前，临床关于HPV整合在宫颈癌早期诊断中的报道较少，但由于地区差异、检测手段及检测方法不同，研究结果也不同。HR-HPV DNA和TCT是目前临床筛查宫颈癌的常用方法，但以上两种方法不能反映出病理状态，不能对宫颈病变程度做出准确的判断，具有一定的局限性。

近年来，临床将HPV E5、E6及E7应用于宫颈癌筛查中，E5、E6及E7过度表达，会导致细胞生长抑制剂失去活性，加快细胞生长、繁殖，最终引发宫颈癌[15]。随着宫颈病变程度的加重，E5、E6、E7拷贝量、阳性表达率均会逐渐增高，因此建议临床将E5、E6、E7应用于宫颈癌HPV检测中[16,17]。E6/E7是高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)主要的致癌基因，其产物对视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)以及抑癌基因p53具有抑制作用，可促进细胞生长，癌细胞过度生长，细胞增殖处于失控状态，从而诱发宫颈癌。HPV病毒整合不仅会诱导癌细胞基因持续性增长，还会影响宿主DNA功能，引发严重的不良后果[18,19]。本研究提示宫颈癌患者随着宫颈病变程度加重，HPV整合率会逐渐增高。HPV基因整合到宿主的染色体中，会破坏E2基因，导致E2基因表达缺失或者低水平表达，中止HPV病毒生命周期，造成致癌基因E6以及E7紊乱，解除对E6以及E7表达的抑制，造成E6、E7高表达，进而抑制抑癌蛋白表达，促进肿瘤细胞增殖失控[20,21]。在低危型HPV感染中，HPV的存在形式以游离形式存在，高危型HPV感染引发的病变中，HPV则会整合到宿主的基因组织中，HPV整合位点的宿主基因会出现大片突变、缺失，因此，目前临床将高危型HPV判定为宫颈恶变的重要标志。在动态观察CIN和宫颈癌的演变过程时，应及早对高危型HPV患者进行对症治疗。检测HPV整合状态，有助于临床医生判定宫颈病变组织的良、恶性，及早预测病变发展程度和方向。

世界范围内，HPV最常见的感染类型是HPV16、HPV18,大约占至宫颈癌HPV感染类型的20%、50%[22,23,24]。但不同地域，HPV感染类型也存在差异。本研究显示，宫颈癌HPV感染类型以HPV18和HPV16为主，与Sabaliauskas等[25]等报道结果接近。HPV18和HPV16均属于高度特异的噬上皮性病毒，持续感染会引起宫颈部位鳞状上皮细胞持续性增殖，诱发基因突变，增加宫颈癌发病率。其他整合基因并不具有高度的特异性，仅仅是协助或者潜伏感染。HPV16感染的CINⅡ,一般很少逆转为低级别病变。HPV16的基因整合形式，会形成一个超级增强子样元件，驱动病毒癌基因转录，而形成的超级增强子，不仅会驱动E6/E7高表达，还会诱导邻近基因转录，增强病毒感染的持续性，这就很好地解释了在不同级别的宫颈病变中，HPV16感染率均较高的现象[26,27]。正常、炎症或CINⅠ的患者中，大部分患者机体中的HPV处于游离状态，并没有与DNA整合，因此，大部分感染HPV的患者可能是一过性感染，会出现HPV检测为阴性的结果。对于CINⅠ及以上的患者，由于HPV可能与DNA发生整合，致癌基因表达活跃，会产生大量的癌蛋白，进而增加了宫颈癌患病风险。本研究存在一定不足，例如样本容量较小、地域分布局限及研究时限较短，对结果的一般性、代表性、普遍性及有效性有所影响，因此，仍旧需临床扩大样本容量、增加不同地域CIN及宫颈癌病例、延长研究时限，为评估HPV整合基因检测在宫颈癌诊断中的临床价值提供更多参考依据。

综上所述，HPV检测在宫颈癌诊断中具有较高的临床价值，宫颈病变程度越严重，HPV整合率越高，临床可通过动态监测HPV,计算HPV整合率，评估宫颈病变严重程度，根据个体差异性制定针对性的治疗方案。

参考文献:

[2]李长忠,崔国英.重视高危型人乳头瘤病毒感染和子宫颈鳞状上皮内病变的过度诊治[J].中国实用妇科与产科杂志,2020,36(7):585-587.

[3]郭瑞丽,朱科科,赵静.宫颈癌及癌前病变中的HPV-16整合人宿主基因组的发生情况及其在宫颈癌筛查中的应用[J].实用癌症杂志,2023,38(11):1810-1812,1816.

[4]张韶凯,罗喜平,李志芳,等.人乳头瘤病毒分型检测在宫颈癌前病变和宫颈癌筛查中的应用价值[J].中华肿瘤杂志,2020,42(3):252-256.

[5]韦梦娜,余艳琴,徐慧芳,等.中国大陆地区不同宫颈病变人群中人乳头瘤病毒感染率及型别分布的系统研究[J].中国肿瘤临床与康复,2020,27(2):133-137.

[6]刘亚飞,沈彦军,杨阳,等.早期有丝分裂抑制因子1对DNA损伤后人乳头瘤病毒16亚型E7基因介导的DNA重复复制的调控作用[J].中国医学科学院学报,2020,42(4):485-490.

[7]闫玉芬,李乐乐,邓梓雯,等.2015-2019年青岛市女性人乳头瘤病毒感染及基因型分布特点[J].中华实验和临床病毒学杂志,2021,35(4):424-428.

[8]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.宫颈癌及癌前病变规范化诊疗指南(试行)[J].中国医学前沿杂志(电子版),2013,6(8):40-49.

[9]李凯.人乳头瘤病毒(HPV)E6/E7mRNA检测在宫颈上皮内瘤变(CIN)2级及以上病变筛查中的应用价值[J].中国实验诊断学,2020,24(2):326-328.

[11]王军,袁纯辉,孙红,等.高危型人乳头瘤病毒16 E6蛋白通过外泌体传递热休克蛋白70调控巨噬细胞介导宫颈癌细胞增殖､侵袭和迁移[J].中华微生物学和免疫学杂志,2020,40(7):538-546.

[12]邵世清,王社莲,张永艳,等.内质网应激相关蛋白与宫颈癌细胞系中人乳头瘤病毒感染的相关性研究[J].中华医院感染学杂志,2020,30(2):224-228.

[13]丛玲华,方来福,顾昕,等.早期生长反应基因在宫颈癌中的表达及与高危型人乳头瘤病毒感染的关系[J].中国妇幼保健,2021,36(2):401-404.

[14]徐志红,王秀,刘小燕,等.宫颈鳞癌中血管内皮生长因子-C､血管内皮生长因子受体-3的表达与人乳头瘤病毒16/18感染的相关性分析[J].中国计划生育和妇产科,2021,13(3):56-59,73.

[15]张滨惠,代金霞,申健.联合应用P16和Ki-67免疫组化染色对宫颈上皮内瘤变分级诊断的影响和与人乳头瘤病毒感染的相关性[J].中国妇幼保健,2021,36(17):4076-4080.

[16]吴永茂,吴季兰,练惠织,等.HPV癌基因E6/E7mRNA在宫颈癌及癌前病变诊断中的临床价值[J].中国妇幼保健,2020,35(2):349-351.

[17]吴霞,桑学梅,宋瑞,等.早期宫颈癌组织中ATG-12表达与HPV16-E6/E7-DNA病毒载量及预后的关系[J].临床肿瘤学杂志,2020,25(3):235-240.

[18]吴秋珍,毛瑛玉,林茂华,等.Aptima HPV E6/E7 mRNA 16,18/45基因型检测技术在宫颈癌前病变和宫颈癌筛查中的应用价值[J].诊断病理学杂志,2021,28(3):202-206.

[19]张丽敏,吕虹,陈柯霖,等.妇科门诊患者宫颈感染人乳头瘤病毒基因分型检测特征分析[J].中国实验诊断学,2020,24(1):121-124.

[20]李娇生,郭一帆,于浩天.HPV阳性宫颈癌细胞中NFX1-123与HPV16 E6的细胞定位关系及其可能作用机制[J].现代肿瘤医学,2023,31(16):2972-2976.

[21]吴晨鹏,刘颖,李雪梅,等.液基细胞学､Aptima HPV E6/E7 mRNA､Cobas 4800 HPV在不同宫颈癌筛查模式下的效果比较[J].诊断病理学杂志,2023,30(2):123-126.

[22]黄麦华,王中东,宗玉龙,等.5 528例妇科患者高危型人乳头瘤病毒感染的基因分型､数量及年龄分布情况[J].中国妇幼保健,2020,35(13):2402-2404.

[23]刘霞,张乔,张慧杰.人乳头瘤病毒16型DNA整合对宫颈癌变的影响[J].中国现代医学杂志,2020,30(9):28-33.

[24]王亚通,许丹,刘文旺,等.TAP与HPV E6/E7､TCT联合应用在不同年龄段宫颈癌筛查中的价值及与组织病理学诊断的一致性[J].国际检验医学杂志,2022,43(13):1644-1647.

[26]路玲,张媛媛,徐瑶,等.宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型E6､人乳头瘤病毒16型E7蛋白表达及DNA病毒载量与调节性T细胞浸润的相关性分析[J].中国性科学,2022,31(9):54-59.

基金资助:浙江省丽水市科技计划项目(2020ZDYF14);

文章来源:于皓,张向东,吕清媛,等.人乳头瘤病毒整合基因检测技术在宫颈癌早期诊治中的应用价值[J].中国妇幼保健,2024,39(08):1400-1403.