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青海省碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌的分子流行病学分析

2024-11-29 138 上传者：管理员

摘要：目的通过研究2022年7月至2023年5月青海省5家医院分离的碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌(CRE)的分布、基因型及耐药性，为临床CRE感染的治疗、院内感染防控，以及抗菌药物制订和评价提供数据支持。方法采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪进行细菌鉴定，采用VITEKⅡcompact进行细菌药敏试验，采用碳青霉烯酶抑制剂增强试验进行产酶表型鉴定，采用聚合酶链反应检测碳青霉烯酶基因(blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM和blaOXA-48)。对分离出的优势菌株进行多位点序列分型(MLST)和同源性分析。结果共分离出59株CRE,其中50株分离自临床标本，9株分离自患者所处的环境；59株CRE中阴沟肠杆菌23株，肺炎克雷伯菌22株，大肠埃希菌7株，产酸克雷伯菌5株，弗氏柠檬酸杆菌和布氏柠檬酸杆菌各1株。CRE主要分离于重症监护病房、烧伤科、肝胆科。标本来源主要为伤口分泌物、痰液、血液。59株CRE对酶抑制剂复合制剂、头孢菌素类、氨曲南及碳青霉烯类等抗菌药物均具有较高的耐药率(87.5%～100.0%),对阿米卡星和替加环素的耐药率相对较低，分别为30.4%和15.5%。最常见的碳青霉烯酶基因型是blaNDM(59.32%,35/59),其次是blaKPC(32.20%,19/59),肺炎克雷伯菌中blaKPC-2检出率最高(72.73%,16/22),阴沟肠杆菌中blaNDM-1检出率最高(69.57%,16/23)。MLST结果显示，肺炎克雷伯菌ST分型主要为ST11型(68.18%,15/22),阴沟肠杆菌ST分型主要为ST97型(26.09%,6/23),9株从患者所处环境中分离出的CRE与临床菌株的ST型一致。结论青海省5家医院分离的CRE耐药率普遍较高，主要以阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌为主，碳青霉烯酶基因以blaNDM和blaKPC为主，耐药问题严重，临床应加强CRE的筛查及控制，预防其在院内传播。

关键词：
CRE
碳青霉烯耐药肠杆菌目细菌
碳青霉烯酶
肺炎克雷伯菌
阴沟肠杆菌
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近年来，碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌(CRE)频繁在临床出现，导致临床对其治疗越来越困难。有研究发现，CRE已成为住院患者发生死亡的主要威胁，已成为严重的全球公共卫生安全问题[1-2]。美国疾病预防控制中心数据显示，2011年CRE对碳青霉烯类药物的耐药率仅为1.2%,2021年已上升至4.2%[3-4]。全国细菌监测网的数据显示，2014-2019年我国肺炎克雷伯菌对亚胺培南耐药率从4.8%上升至10.5%[5]。GUDUCUOGLU等[6]对重症监护病房(ICU)8例患者分离的9株CRE的研究结果显示，其中5例患者在平均12 d内死于感染，病死率高达62.5%。国内有学者研究发现，CRE引起的血流感染病死率已超过40%[7]。已有研究表明，CRE引起的感染给临床治疗和医院感染控制带来巨大挑战[8]。本研究通过收集青海省5家医院临床标本及患者所处环境中的CRE,分析其药敏情况、耐药基因、产酶类型及同源性，为青海省CRE监测工作提供数据支持，为提高青海省CRE导致的感染性疾病的治愈率，以及指导医院感染控制工作和防止院内CRE暴发提供实验室依据。

1、材料与方法

1.1 菌株来源

根据美国疾病预防控制中心关于CRE的判断标准[9],收集2022年7月至2023年5月青海省5家医院临床标本及患者所处环境中分离的59株CRE为研究对象。

1.2 仪器与试剂

细菌鉴定所需试剂购于美国sigma公司和德国Bruker Daltonics公司，聚合酶链反应(PCR)扩增所需全部试剂购于生工生物工程(上海)股份有限公司。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(德国Bruker Daltonics公司)、Quant Studio 5荧光定量PCR仪(美国赛默飞世尔科技公司)、全自动微生物鉴定和药敏VITEK Ⅱ compact(法国生物梅里埃公司)、凝胶成像仪(美国Bio-rad公司)、电泳仪(北京六一生物科技有限公司)。

1.3 菌株鉴定及药敏试验

将待测菌株用血平板传代后置于35 ℃培养18～24 h, 采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪进行鉴定，采用微量肉汤法进行药敏试验。替加环素的药敏折点参考美国食品药品监督管理局推荐标准，其他药敏折点参照美国临床和实验室标准协会2022年版标准，其中头孢哌酮/舒巴坦的折点采用头孢哌酮的折点。

1.4 碳青霉烯酶表型及耐药基因检测

1.4.1 碳青霉烯酶抑制剂增强试验

碳青霉烯酶抑制剂增强试验操作及结果判读参考《肠杆菌目细菌碳青霉烯酶的实验室检测和临床报告规范专家共识(第二版)》中的描述进行。肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705和ATCCBAA-2146为质控菌株。

1.4.2 耐药基因检测

将实验菌株接种于血平板上三区划线，培养出单个菌落，37 ℃培养箱孵育18～24 h; 次日挑取数个单个菌落，装入有400 μL高压无菌水的1.5 mL EP管中，振荡混匀；将EP管置于沸水中高温煮沸10 min, 以12 500 r/min离心5 min, 吸取上清液即菌株DNA提取液于另一高压灭菌的EP管中，弃去沉渣，置于-20 ℃冰箱中保存备用。PCR反应体系为50 μL:正、反向引物各1 μL,DNA模版5 μL,Taq PCR Mix预混液25 μL和18 μL ddH2O。PCR反应条件为94 ℃预变性2 min, 94 ℃变性30 s, 引物序列、扩增产物大小及退火温度见表1。退火时间均为30 s, 72 ℃延伸30 s, 30个循环后72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，序列经BLAST比对分析，确定CRE的基因型。阳性质控菌株同1.4.1。

1.5 多位点序列分型(MLST)及同源性分析

1.5.1 MLST

分别扩增肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌的7对管家基因进行MLST,管家基因扩增产物具体见表2、3。将PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果进行MLST分析，经比对后确认肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌的ST型别。

1.5.2 同源性分析

采用UPGMA方法对阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌进行同源性分析。

表1耐碳青霉烯酶基因引物序列

表2肺炎克雷伯菌MLST引物序列

表3阴沟肠杆菌MLST引物序列

1.6 统计学处理

采用WHONET5.6软件和Excel2021对实验数据进行统计分析。

2、结果

2.1 CRE的科室及标本来源分布情况

2022年7月至2023年5月从青海省5家医院共分离出50株CRE,从患者所处环境分离出9株CRE。分离的细菌中阴沟肠杆菌23株，检出率为38.98%;肺炎克雷伯菌22株，检出率为37.29%;大肠埃希菌7株，检出率为11.86%;产酸克雷伯菌5株，检出率为8.47%;弗氏柠檬酸杆菌和布氏柠檬酸杆菌各1株，检出率为1.69%。CRE科室来源依次为重症监护病房24株，检出率为40.68%;烧伤科7株，检出率为11.86%;肝胆科6株，检出率为10.17%;骨科、肾病科和康复科均为3株，检出率为5.08%;急诊外科和泌尿外科均为2株，检出率为3.39%。CRE标本来源依次为伤口分泌物12株，检出率为20.34%;痰液11株，检出率为18.64%;血液9株，检出率为15.25%;尿液6株，检出率为10.17%;腹水和灌洗液均为5株，检出率为8.47%;胆汁2株，检出率为3.39%。

2.2 CRE药敏试验结果

59株CRE对阿米卡星和替加环素的耐药率相对较低，分别为30.4%和15.5%,对其他抗菌药物的耐药率相对较高(87.5%～100.0%)。见表4。

2.3 碳青霉烯酶抑制剂增强试验和耐药基因检测结果

根据《肠杆菌目细菌碳青霉烯酶的实验室检测和临床报告规范专家共识(第二版)》中碳青霉烯酶抑制剂增强试验判读标准，59株CRE均产碳青霉烯酶，其中A类碳青霉烯酶19株(32.20%,19/59),B类碳青霉烯酶40株(67.80%,40/59)。碳青霉烯酶基因包括35株blaNDM(59.32%,35/59),19株blaKPC(32.20%,19/59),6株blaVIM(10.17%,6/59),5株blaIMP(8.47%,5/59),1株OXA-48(1.69%,1/59)。肺炎克雷伯菌中blaKPC-2检出率最高(72.73%,16/22),阴沟肠杆菌中blaNDM-1检出率最高(69.57%,16/23)。59株产碳青霉烯酶CRE基因型分布见表5。

表4 CRE药敏试验结果

2.4 患者所处环境分离菌株与临床CRE结果分析

本研究共有9株CRE来自患者所处环境，其中肺炎克雷伯菌4株，阴沟肠杆菌3株，大肠埃希菌2株。

2.5 MLST分析及聚类分析

23株阴沟肠杆菌MLST结果为ST97型6株(26.09%),ST1283型2株(8.70%),ST78型2株(8.70%),ST66型2株(8.70%),ST331型2株(8.70%),ST336型2株(8.70%),ST527型1株(4.35%),ST1641型1株(4.35%),ST231型1株 (4.35%),ST595型1株 (4.35%),ST270型1株(4.35%),未分型2株(8.70%)。22株肺炎克雷伯菌MLST结果为ST11型15株(68.18%),ST4270型1株(4.55%),ST966型1株(4.55%),ST281型1株(4.55%),ST45型1株(4.55%),ST1074型1株(4.55%),ST14型1株(4.55%),ST15型1株(4.55%)。9株从患者所处环境中分离出的CRE与临床菌株的ST分型一致。

表5 59株产碳青霉烯酶CRE的基因型分布情况(n)

3、讨论

近年来，碳青霉烯类抗菌药物被临床广泛用来治疗多重耐药菌感染，因其具有广谱抗菌作用，从而成为治疗多重耐药菌的首选药物[10],这也成为CRE分离株急剧增加的重要原因之一。CRE引起的感染由于治疗选择有限，导致其病死率往往较高[11-12]。一项由北京大学人民医院WANG等[13]牵头的国内多中心研究结果表明，2012-2016年中国25个省的65家医院收集了1 801株CRE,排名前3的分别是肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌和阴沟肠杆菌。而本研究CRE排名前3的分别是阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌，与WANG等[13]的研究不同。本研究中检出CRE最多的标本为伤口分泌物，而肖晓等[14]对167株CRE的研究显示标本来源主要是痰液。由此说明，不同地区CRE的菌种构成及标本来源有地域差异，尽快开展本地区有关CRE的监测，对防控CRE感染至关重要。

药敏试验结果显示，59株CRE对阿米卡星和替加环素的耐药率相对较低，分别为30.4%和15.5%,对其他抗菌药物的耐药率相对较高(87.5%～100.0%)。由此提示，青海省CRE的耐药率相对较高，在治疗CRE引起的感染时应引起高度关注，在今后工作中尽快开展CRE联合药敏试验，对CRE抗感染治疗非常有帮助。近年来，烧伤病房中泛耐药的鲍曼不动杆菌不断增多，亚胺培南、美罗培南、替加环素等被广泛用于烧伤患者救治中，在抗菌药物选择性压力下，随着时间推移，烧伤患者CRE检出率也在逐步增加，后期调查发现，本研究中的烧伤患者均存在上述抗菌药物的使用。本研究中12株伤口分泌物标本中烧伤科占7株，提示烧伤患者面临CRE感染的风险较其他科室更高，在今后的工作中应高度关注烧伤患者，及时对本地区烧伤患者开展CRE主动筛查，从而降低CRE的感染风险。肖晓等[14]通过对167株CRE分析发现，入住ICU超过7 d、气管插管、使用过碳青霉烯类抗菌药物等都是CRE感染的高危风险因素。本研究分离的59株CRE主要分离于ICU、烧伤科、肝胆科等，均存在上述一项或多项危险因素，由此提示，对存在上述风险因素的患者，应及早进行CRE风险管理，对防治CRE院内感染具有重要作用。对于上述CRE风险因素的研究，作者将在后续工作中继续跟进。

CRE的主要耐药机制是产碳青霉烯酶，其次是产超广谱β内酰胺酶和AmpC酶，且合并外膜孔蛋白表达下调或缺失[15-17]。目前blaKPC和blaNDM是我国主要的CRE流行基因型，比较少见的是blaIMP、blaVIM和blaOXA型[18-19]。本研究中共分离出59株CRE,其中阴沟肠杆菌23株占首位(38.98%),其次为肺炎克雷伯菌22株(37.29%),携带blaNDM碳青霉烯酶基因的菌株占59.32%,blaKPC占32.20%,特别是携带blaNDM基因的阴沟肠杆菌构成比达到91.30%(21/23),由此说明，青海省CRE的主要流行株和流行基因型与全国不太一致，在今后的工作中更应该关注携带blaNDM基因型的阴沟肠杆菌。据调查，青海省大多数医院不开展CRE酶型和基因型检测，通过本研究发现，本地区分离出泛耐药阴沟肠杆菌时，首先考虑其为携带blaNDM型碳青霉烯酶基因的菌株，这对临床及时治疗具有重要提示。有研究发现，同时携带两种及两种以上碳青霉烯酶基因的CRE比携带一种耐药基因的CRE具有更强的耐药性[20-21],本研究中同时携带两种耐药基因的CRE占11.86%(7/59),提示要做好本地区CRE的监测工作，谨防携带多种耐药基因的CRE在本地区流行。国内已有研究发现，ST11型碳青霉烯酶耐药的高致病性肺炎克雷伯菌菌株具有高致病性、多重耐药和高度传播性，已对人类健康构成重大威胁[22]。本研究中22株肺炎克雷伯菌MLST主要为ST11型，部分肺炎克雷伯菌拉丝试验阳性，提示为高毒力肺炎克雷伯菌的风险较高，其毒力基因检测将在后续工作中继续跟进。对此应采取更加科学、规范的控制措施，防止ST11型高毒力肺炎克雷伯菌在青海省内交叉传播。目前有研究发现，肺炎克雷伯菌ST11型的流行与blaKPC-2广泛传播之间密切相关，而阴沟肠杆菌的ST型与blaNDM-1的高流行率、广泛地理分布关系不大[20]。已有研究发现，携带blaNDM-1基因的阴沟肠杆菌的耐药质粒能够广泛重组并转移，最终导致患者出现较高的病死率[23]。本研究发现，青海省CRE以阴沟肠杆菌为主，携带blaNDM-1基因型菌株占比高达42.37%(25/59),在今后工作中将重点对高原地区有关携带blaNDM-1基因的阴沟肠杆菌耐药质粒的重组、转移及致死率进行相关研究。本研究中共有9株CRE分离于患者所处的环境，ST分型结果与临床标本分离的CRE一致。因此，在今后的院内感染控制中应高度关注CRE,以控制和预防这类细菌在院内传播流行。

青海省地处青藏高原，经济和医疗条件相对落后，及时对省内CRE进行监测有重要意义。本研究发现，青海省CRE仅对替加环素和阿米卡星等少数抗菌药物呈较好的敏感性，其他抗菌药物的耐药率整体较高，而单药在治疗CRE引起的感染时效果往往不佳，提示在治疗CRE引起的感染时需要多种抗菌药物联合使用。本研究还发现，青海省CRE以阴沟肠杆菌为主，耐药基因以blaNDM为主，在今后的工作中及早开展耐药表型、基因型及联合药敏试验，对临床治疗CRE引起的感染有重要作用。考虑到本研究纳入的菌株和医院数量较少，故本研究结果可能具有一定的局限性，在后期研究中将纳入更多的医院和CRE菌株，从而使青海省CRE的分布、基因检测及耐药性分析的相关研究更具代表性。

参考文献:

[5]全国细菌耐药监测网.全国细菌耐药监测网2014-2019年老年患者常见临床分离细菌耐药性监测报告[J].中国感染控制杂志,2021,20(2):112-123.

[14]肖晓,杭修兵,王梦,等.耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌耐药性､临床感染特征及mcr基因分析[J].中国感染控制杂志,2023,22(1):31-37.

[19]邓燕燕,龚倩,李牧,等.神经外科碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌的耐药率及耐药基因分析[J].检验医学与临床,2023,20(8):1072-1076.

基金资助:青海大学附属医院中青年科研基金项目(ASRF-2021-YB-18);科技基础资源调查专项(2019FY101208);

文章来源:何轶群,扎拉加,李娟,等.青海省碳青霉烯类耐药肠杆菌目细菌的分子流行病学分析[J].检验医学与临床,2024,21(22):3352-3358.