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基于PCR循环阈值的SARS-CoV-2奥密克戎变异株的实验室分析

2024-06-13 47 上传者：管理员

摘要：目的分析新型冠状病毒感染人群的鼻拭子和咽拭子标本的循环阈(Ct)值，为流行病学调查和临床预测等提供一定的理论依据。方法对2022年4月1日至7月31日本实验室接收的SARS-CoV-2核酸阳性人群的鼻拭子和咽拭子标本，运用磁珠法进行核酸提取，用实时荧光定量PCR检测SARS-CoV-2核酸的ORF1ab基因和N基因两个靶标，分析两类标本中两个靶标的Ct值。Ct值差异用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。结果 SARS-CoV-2核酸阳性标本401例，男性243例、女性158例(男女比例1.54∶1);SARS-CoV-2核酸阳性人员年龄分布为7个月～91岁，中位数为39岁；临床分型为普通型31例，轻型281例，无症状感染者89例。同时采鼻拭子和咽拭子的106例，两类标本ORF1ab基因(t=7.728,P<0.001)和N基因(t=7.504,P<0.001)Ct值差异均有统计学意义。在同一人不同时间送检鼻拭子或咽拭子的73例标本中，采样时间间隔≤48h的标本26例，两次Ct值差值的绝对值>2的标本占61.54%(16/26),末次Ct值≤30的标本占61.5%(16/26);采样时间间隔>48h的标本56件，两次Ct值差值的绝对值>2的标本占82.1%(46/56),末次Ct值>30的标本占98.2%(55/56)。结论 SARS-CoV-2奥密克戎变异株感染者的临床分型以轻型为主；鼻拭子标本的病毒载量高于咽拭子；采样时间间隔≤48h的标本，若Ct值快速下降且末次Ct值≤30,大多为新发感染人员；若末次Ct值>30则大多为复阳人员。Ct值仅有一定的提示作用，对于COVID-19人群的临床情况预测、感染者当下状态及何时参与社会活动，要根据其临床情况连同实验室结果进行评估。

关键词：
CT值
PCR
咽拭子
新型冠状病毒
鼻拭子
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实时荧光定量PCR是目前检测新型冠状病毒有效的实验方法之一[1,2],具有100.0%的特异性和91.8%(83.8%～96.6%)的灵敏性[3],通常比较低的病毒载量(20～100拷贝RNA/ml)[4]就可以被检测到，目前市面上批准的试剂盒检测限为100～1 000拷贝RNA/ml[5]。PCR循环阈值(Ct值)是一个半定量值，与样品中的RNA含量呈反比[6]。2022年4月1日—7月31日北京市疾病预防控制中心测序结果显示房山区的新型冠状病毒流行株为奥密克戎变异株[7],现将实验室检测的SARS-CoV-2核酸阳性数据分析如下。

1、对象与方法

1.1 研究对象

2022年4月1日—7月31日本实验室接收的SARS-CoV-2核酸阳性人群的鼻拭子和咽拭子标本。

1.2 检测仪器及试剂

用磁珠法的自动核酸提取仪(济凡自动核酸提取仪Purifier 96)及其匹配的核酸提取试剂(批号/效期：20220114/20230124)进行核酸提取；新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(实时荧光定量PCR法)购自武汉明德生物科技股份有限公司(批号/效期：220321/20230122),按说明书进行反应程序的编辑及体系配制等；样本检测使用的扩增仪器为美国伯乐CFX 96实时荧光定量PCR仪。

1.3 统计分析

采用WPS Office 2017和R语言对数据进行分析，鼻拭子和咽拭子SARS-CoV-2靶标ORF1ab基因和N基因Ct值方差齐性采用方差齐性检验(Levene′s检验),Ct值差异用独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。检验水准α=0.05。

2、结果

2.1 流行病学特征

SARS-CoV-2核酸阳性人员401例，男性243例、女性158例(男女比为1.54∶1);年龄分布于7个月～91岁，中位数为39岁；人群分布：家务及待业101例，其他职业69例，学生62例，工人49例，干部职员28例，餐饮食品业18例，商业服务17例，农民14例，散居儿童12例，离退人员9例，托幼儿童8例，教师6例，公共场所服务员2例，海员及长途驾驶员2例，民工2例，医务人员2例；临床分型：普通型31例，轻型281例，无症状感染者89例。

2.2 鼻拭子和咽拭子COVID-19者的Ct值

同时采鼻拭子和咽拭子的106例，进行ORF1ab基因和N基因两个靶标检测，结果为94例的鼻拭子Ct值高于咽拭子Ct值，12例的鼻拭子Ct值低于咽拭子Ct值。ORF1ab基因Ct值在鼻拭子标本中的平均值为(25.22±5.01),咽拭子标本中的平均值为(30.28±4.45);N基因Ct值在鼻拭子标本中的平均值为(23.85±5.44),咽拭子标本中的平均值为(29.13±4.75)。两类标本ORF1ab基因的Ct值经过Levene′s检验Ct值为方差齐，符合正态分布(F=1.991,P=0.160),Ct值差异有统计学意义(t=7.728,P<0.001);两类标本N基因Ct值经过Levene′s检验Ct值方差齐，符合正态分布(F=3.626,P=0.058),Ct值差异有统计学意义(t=7.504,P<0.001)。

2.3 采样时间不同的同种类型标本的Ct值

同一人不同时间送检的鼻拭子或咽拭子标本73例，按采样时间间隔是否达到48h进行分组，采样时间间隔≤48h的26例，>48h的56例，其中9例既有采样时间间隔≤48h, 又有采样时间间隔>48h的标本。采样时间间隔≤48h的标本：首次测得的Ct值高于末次的Ct值且差值>2,为病毒载量升高，有12例，其中10例末次Ct值≤30,2例末次Ct值>30(其中1例为复阳);两次送检标本的Ct值相差≤2,为病毒载量无较大变化，有10例，其中4例末次Ct值≤30(此4例的Ct值为20～27),6例末次Ct值>30(其中5例为复阳);首次测得的Ct值低于末次的Ct值且差值>2,为病毒载量降低，共4例，其中2例末次Ct值≤30,2例>30(2例均为复阳)。采样时间间隔>48h的标本：首次测得的的Ct值高于末次的Ct值且差值>2,有3例，均为末次Ct>30;两次标本的Ct值相差≤2的10例，其中1例末次Ct值≤30(两次采样时间间隔为3d),9例末次Ct值>30;首次测得的Ct值低于末次的Ct值且差值>2的43例，均为末次Ct值>30。见表1。

表1 同一人检测时间间隔不同但样本类型相同的Ct值情况(例)

3、讨论

本文结果显示，新型冠状病毒奥密克戎变异株男性感染者多于女性，多篇文章报道男性感染者[8]或男性重症感染者多于女性[9,10],许多因素可导致疾病结果的性别差异。例如，雌激素已被证明可导致炎症期间单核细胞趋化蛋白1表达的下调，从而抑制Toll样受体4介导的巨噬细胞核因子κB活化，最终导致单核巨噬细胞募集的抑制。为了进一步支持这一观点，研究人员发现用雌激素受体拮抗剂或卵巢切除术切除卵巢后治疗的被SARS-CoV-2感染的雌性小鼠，其总体死亡率增加。本文中新型冠状病毒感染者分布于7个月～91岁，各年龄人群均易感，与其他报道结果一致[11]。有报道指出与感染SARS-CoV-2奥密克戎变异株相比，儿童[12]、>60岁的老人[13]感染德尔塔变异株更易出现重症。本文结果显示，SARS-CoV-2奥密克戎变异株感染人群的主要临床分型为轻型，其次为无症状感染者，未出现重型及危重型，与其他报道结果一致，进一步佐证了奥密克戎变异株的致病力下降。本文结果显示，大多数SARS-CoV-2感染者鼻拭子的Ct值较咽拭子高，差异有统计学意义(ORF1ab基因：t=7.728,P<0.001;N基因：t=7.504,P<0.001)。有报道提到鼻拭子病毒含量高于咽拭子[14]或鼻拭子SARS-CoV-2核酸阳性检出率高于咽拭子[15],但也有报道显示鼻拭子和咽拭子检测出的Ct值无统计学差异[16]。原因可能是其收集的标本为2020年1月—2月，而本文采集的标本为2022年4月—7月，有研究显示2021年1月—2022年1月SARS-CoV-2奥密克戎变异株在鼻拭子中的病毒载量比德尔塔变异株高且Ct值下降[17]。本文结果显示采样时间间隔≤48h的标本，若Ct值快速下降且末次Ct值≤30,则大多为新发感染人员；若末次Ct值>30则大多为复阳人员；采样间隔>48h的标本，末次Ct值>30则大多为感染人员且处于排毒衰减期。康复后的COVID-19者通过实时荧光定量PCR重新检测到SARS-CoV-2的现象较普遍[18],本文中也遇到复阳人员且Ct值>30者居多，提示Ct值不能将病毒载量完全量化[19],也不能判断病毒的生存力或传染性[20]。Ct值仅有一定的提示作用，对于COVID-19者的临床情况预测、感染者当下状态及何时可参与社会活动，要根据其临床情况连同实验室结果一起进行评估。

参考文献:

[10]任敏睿,汤巧雨,高玺玉,等.新型冠状病毒肺炎首发临床症状特征分析[J].国际病毒学杂志,2021,28(3):196-200.

[13]王海峰,李亚飞,潘静静,等.≥60岁老年人群感染不同新冠病毒变异株临床症状及严重程度分析[J].中国公共卫生,2022,38(8):968-974.

[14]陈荣华,李勤光,赵敏,等.4例新型冠状病毒感染病例鼻拭子､咽拭子病毒核酸检测和血浆抗体检测结果分析[J/OL].病毒学报,2021,[2023-01-06].

[15]牛卫东,段江洋,蒋诗苑,等.咽拭子､鼻拭子､痰液中SARS-CoV-2核酸检测结果一致性及检出率分析[J].传染病信息,2020,33(4):307-311.

[16]周兰兰,魏泉德,焦亮,等.咽拭子和鼻拭子标本新型冠状病毒核酸检测效果分析[J].中华实验和临床病毒学杂志,2021,35(6):710-713.

基金资助:科技部国家重点研发计划——Omicron变异株新冠肺炎患者核酸复阳传染性､致病性及其在病毒变异中的作用机制研究(2023YFC0872400);

文章来源:刘海波,于海柱,高舒,等.基于PCR循环阈值的SARS-CoV-2奥密克戎变异株的实验室分析[J].医学动物防制,2024,40(08):784-786+792.