铜绿假单胞菌(PA)在医院内是检出最多的病原菌之一，在自然界中广泛存在，它属于一种条件致病菌[1],也是导致院内获得性肺炎的主要原因。有研究表明，在医院内感染的细菌中，PA感染程度更严重，其对抗菌药物的耐药性逐渐增加。由于耐碳青霉烯类抗菌药物的使用频率增加，导致耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(CR-PA)检出率越来越高，临床治疗CR-PA感染越来越困难。Ⅲ型分泌系统(T3SS)是PA感染的主要系统，其主要由4种毒力基因(exoT、exoY、exoS和exoU)构成[2]。exoT基因在PA中普遍表达，其能够攻击宿主的炎症细胞[3];exoY具有核苷酸环化酶的作用，造成细胞膜通透性明显改变而发生水肿破裂；exoS基因能够抵御宿主细胞吞噬作用，诱导细胞凋亡机制发生；exoU具有磷脂酶A2活性，对宿主细胞的细胞膜有伤害作用，加速细胞裂解破坏死亡[4]。本文主要对临床分离的耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌表达的毒力基因进行鉴定，掌握本院CR-PA菌株携带exoT、exoY、exoS和exoU基因组合形式，研究不同组合的毒力基因型对常见抗菌药物耐药率，指导临床更精准地治疗CR-PA菌株的感染。

1、材料与方法

1.1菌株来源

收集安徽医科大学附属安庆第一人民医院检验科2022-2023年临床检出的CR-PA 87株。所有CR-PA菌株均采用质谱仪及法国梅里埃Vitek2- Compact仪器进行检测鉴定。

1.2仪器与试剂

血平板、Vitek2-Compact细菌鉴定仪购自法国梅里埃公司，药敏纸片、Tap PCR Master Mix、DNA Maker DL600、核酸染料、上样缓冲液、琼脂糖凝胶均购自江苏愚公生物科技公司，电泳仪购自兰杰柯生物科技有限公司，聚合酶链反应(PCR)仪购自天隆生物科技有限公司，胰蛋白胨购自杭州百思生物科技有限公司。4种毒力基因引物参照文献[5]合成，引物序列由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1 PCR引物合成序列

1.3菌株鉴定及药敏试验

采用质谱仪及Vitek2-Compact仪器对临床检出的CR-PA进行鉴定及药敏试验，采用2022版美国临床和实验室标准协会标准将所检测的药敏试验结果分析判读。采用纸片扩散法对相关抗菌药物进行补充。药敏试验结果采用WHONET5.6软件进行分析，实验采用的PA质控菌株为ATCC27853。

1.4细菌DNA提取

采用煮沸法提取细菌基因组DNA,取分离培养的CR-PA菌落1～2个放入1.5 mL离心管中，加入300μL ddH2O,在100℃水浴锅中加热10 min,然后采用离心机以12 000 r/min离心5 min,收集上清液细菌DNA,将提取的DNA放入-20℃冰箱保存。

1.5检测T3SS毒力基因

采用PCR检测毒力基因，PCR反应体系：正向引物1μL,反向引物1μL,DNA模板2μL,2×Tap PCR Master Mix 20μL,26μL ddH2O,反应总体系50μL。PCR反应程序：95℃预变性5 min, 95℃变性30 s,退火温度55℃30 s,延伸72℃30 s,共32个循环，最后72℃延伸10 min,最终于4℃保存产物。PCR产物用3%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.6 PCR产物测序

PCR阳性产物委托上海生工生物工程有限公司对其测序，测序结果与美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库发布收录的基因序列进行分析比对。

1.7统计学处理

采用SPSS24.0统计软件进行数据分析处理。菌株标本来源及科室分布采用例数或百分率描述。不同致病毒力基因型对常用抗菌药物的耐药性采用χ2检验进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

2.1 87株CR-PA科室分布情况

从不同科室检出87株CR-PA,来源科室依次为重症监护病房(ICU)28株(32.18%),神经外科25株(28.74%),呼吸内科5株(5.75%),肿瘤科4株(4.60%),康复医学科4株(4.60%),急诊科4株(4.60%),胃肠外科3株(3.45%),肝胆外科3株(3.45%),其他科室11株(12.64%)。

2.2 87株CR-PA标本分布情况

87株CR-PA标本主要集中在痰液标本与分泌物标本，痰液标本占比最高，为64株(73.56%),分泌物标本14株(16.09%),中段尿标本5株(5.75%),血液标本2株(2.30%),其他标本2株(2.30%)。

2.3 87株CR-PA对12种常见抗菌药物的耐药率

87株CR-PA对常见抗菌药物耐药率最高的是替卡西林/克拉维酸，为77.0%,其次是亚胺培南(70.1%)和美罗培南(63.2%);耐药率最低的抗菌药物是黏菌素，仅为8.0%。87株CR-PA对大部分抗菌药物均有一定的耐药性，其耐药率均高于30.0%,如头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、亚胺培南、美罗培南、左氧氟沙星、替卡西林/克拉维酸、哌拉西林等。药敏试验结果见表2。

表2 87株CR-PA对常见抗菌药物的药敏试验结果(%)

2.4 T3SS的4种毒力基因分布

87株CR-PA检出4种毒力基因(exoT、exoY、exoS、exoU),其中exoT和exoY基因阳性率均为100.00%(87/87),exoS基因阳性率为77.01%(67/87),exoU基因阳性率为27.59%(24/87)。PCR阳性基因电泳图见图1。本研究共检出4种类型的毒力基因型组合，以exoT+/exoY +/exoS+/exoU-基因型组合为主，阳性率为71.26%(62/87),其次是exoT+/exoY+/exoS-/exoU+基因型组合，阳性率为21.84%(19/87),exoT+/exoY+/exoS+/exoU+基因型组合阳性率为5.75%(5/87),exoT+/exoY+/exoS-/exoU-基因型组合阳性率为1.15%(1/87)。T3SS毒力基因及基因型组合在不同年龄、性别中的分布情况见表3。

2.5毒力基因测序

PCR产物送去上海生工生物工程有限公司测序，将测得的exoT、exoY、exoS和exoU基因序列与NCBI数据库收录的基因序列进行分析比对，一致性均在97%以上，测序结果见图2。

图1致病毒力基因PCR阳性产物电泳图

表3 T3SS毒力基因及基因型组合在不同年龄、性别患者中的分布情况比较[n(%),n=87]

图2毒力基因测序结果

2.6 exoS与exoU基因在87株CR-PA标本中的分布情况

87株CR-PA检测的菌株全部含有exoT与exoY基因，在此不单独分析。不同标本均以exoT+/exoY+/exoS+/exoU-基因型组合为主，其中痰液标本基因构成比为67.19%(43/64),分泌物标本基因构成比为78.57%(11/14),中段尿标本基因构成比为100.00%(5/5)。exoS基因总阳性率在痰液标本中的构成比为71.88%(46/64),分泌物标本为85.71%(12/14),中段尿标本为100.00%(5/5);exoU基因总阳性率在痰液、分泌物及中段尿标本中的构成比分别为32.81%(21/64)、14.29%(2/14)和0.00%(0/5)。exoS与exoU基因型标本构成情况见表4。

表4 exoS与exoU基因型标本构成情况比较(%)

2.7不同基因型组合CR-PA对常见抗菌药物的耐药率比较

CR-PA携带的毒力基因主要存在两种组合形式，以exoT+/exoY+/exoS+exoU-和exoT+/exoY+/exoS-exoU+基因型组合为主，两种基因型组合对抗菌药物的耐药性有差异。药敏试验结果显示，exoT+/exoY+/exoS-exoU+基因型组合对大部分常见抗菌药物，如阿米卡星、妥布霉素、头孢吡肟、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、环丙沙星、哌拉西林的耐药率均明显高于exoT+/exoY+/exoS+exoU-基因型组合，差异均有统计学意义(P<0.05)。exoT+/exoY+/exoS-exoU+基因型组合对抗菌药物的耐药率大部分在50.0%以上，耐药情况明显。exoS与exoU两种基因组合对不同抗菌药物的耐药率见表5。

表5不同基因型组合CR-PA对常见抗菌药物的耐药率 比较(%)

3、讨 论

PA在临床上属于最重要的非发酵革兰阴性杆菌，是一种条件致病菌。在免疫力低下时，PA可引发多种感染，如烧伤感染、导管尿路感染、血流感染及囊性纤维化肺炎等[6]。PA有非常复杂的耐药机制，主要包括内在性、获得性和适应性3种途径[7-8]。CR-PA主要存在于ICU、神经外科、呼吸科等重点科室[9-12],它的检出对相关科室提出了重要挑战，由于耐药机制复杂导致治疗非常棘手。PA致病机制中，T3SS是一个至关重要的感染途径，该系统受到多种精密复杂的调控，能造成宿主细胞的免疫系统破坏[13],增加感染风险，它会加重感染的严重程度，从而影响患者的临床表现及预后康复。T3SS是由于PA为了保护自己不被消灭而进化的系统，主要分泌exoT、exoY、exoS和exoU 4种效应蛋白，从而发挥杀伤细胞的作用。exoT能够诱导细胞凋亡，这个功能使exoT成为一种有效的致命毒性蛋白。除此之外，exoT还可调节激酶活化，对宿主细胞的吞噬功能产生巨大影响，促使PA逃避宿主免疫系统的杀伤清除。exoY含有核苷酸环化酶的功能，它可以破坏宿主细胞的免疫屏障，导致免疫力低下患者发生急性或慢性感染。exoU是一种含有磷脂酶A2活性，并且有高毒性的致病分泌蛋白，能够造成宿主细胞迅速破坏裂解，它常与严重的急性肺损伤、败血症死亡相关[14-15]。exoS能够抵抗宿主细胞吞噬杀伤，诱导细胞发生凋亡，它的毒性作用仅仅低于exoU,能够促使PA在极端宿主免疫应答下生存，被认为是PA存活必不可少的重要致病毒力基因。

本研究主要是对临床分离的87株CR-PA进行分析，病原菌主要来自ICU与神经外科，标本类型主要是痰液73.56%(64/87)及分泌物16.09%(14/87),与孙慕溱等[16]研究结果相似，所有CR-PA都携带T3SS毒力基因。检出的CR-PA全部携带exoT与exoY基因，阳性率为100.00%,但是exoS和exoU基因阳性率不同，exoS基因为77.01%,exoU基因为27.59%。虽然检出的exoU基因占比少，但是该基因的细胞毒性被认为是exoS的100倍。通常情况下，exoS和exoU基因一般不会同时出现，具有排他性，主要以exoS+exoU-(侵袭型)或exoS-exoU+(细胞毒型)的组合方式出现。本研究共检出4种T3SS毒力基因型组合，以exoT+/exoY+/exoS+/exoU-基因型组合为主，占71.26%,与周凯等[17]研究数据相似。另外3种基因型组合形式分别为exoT+/exoY+/exoS-/exoU+(21.84%)、exoT+/exoY+/exoS+/exoU+(5.75%)、exoT+/exoY+/exoS-/exoU-(1.15%)。在痰液标本中，exoS+/exoU-基因型与exoS-/exoU+基因型阳性率均最高，与方雪瑶等[18]研究相同。exoU基因主要出现在痰液标本中，可能与它的致病机制有关。国外HARDY等[14]研究表明，exoU通过靶向宿主质膜和诱导caspase-1介导的炎症通路，破坏肺微血管内皮细胞屏障的完整性，对肺部造成严重损伤，导致重症肺炎发生。毒力基因检测结果与国外OLANIRAN等[19]研究数据相似，exoS与exoU基因存在的主要形式为exoS+/exoU-,说明在不同地区exoS与exoU基因的组合存在相似性。87株CR-PA全部含有T3SS毒力基因，说明该系统对PA的感染致病性具有重大作用。

作为院内感染的重要病原菌之一，入住ICU的患者更趋向产生CR-PA,治疗多重耐药的PA面临非常大的挑战[20]。exoS与exoU基因存在两种组合形式，exoT+/exoY+/exoS-/exoU+基因型组合对大部分常见抗菌药物耐药率均高于exoT+/exoY+/exoS+/exoU-基因型组合，如阿米卡星、妥布霉素、头孢吡肟、头孢他啶、头孢哌酮/舒巴坦、环丙沙星、哌拉西林，差异均有统计学意义(P<0.05),与文献[21]报道相似。携带exoT+/exoY+/exoS-/exoU+基因型对喹诺酮类抗菌药物耐药率高，可能与其gyrA基因突变及外排泵表达过度有关，使其耐药率急剧上升。药敏试验结果显示，CR-PA对黏菌素的耐药率非常低，仅为8.0%,表明难治性CR-PA可采用黏菌素联合其他抗菌药物进行治疗，这将作为最后的治疗策略。

综上所述，本研究主要发现T3SS的4种毒力基因型组合形式。不同的CR-PA毒力基因型之间耐药率存在差异，应针对不同基因型组合选择合适的抗菌药物，确保患者用药的科学性与安全性。分析院内CR-PA毒力基因型，可为医院感染预防控制CR-PA提供理论依据。

参考文献:

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基金资助:安徽省高校自然科学研究项目(2023AH053435);安庆市2022年度医疗卫生类自筹经费科技计划项目(2022Z3006);皖南医学院校级科研项目(JXYY202279);

文章来源:刘康,王万俊,王亚平,等.耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌毒力基因的表达与耐药性研究[J].检验医学与临床,2024,21(15):2193-2197.