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外周血microRNA-24、YKL-40与与肺功能和治疗结局的相关性

2020-06-23 174 上传者：管理员

摘要：目的：探讨病毒性肺炎患儿外周血清microRNA-24(miR-24)和YKL-40表达水平的变化,以及与肺功能和治疗结局的相关性。方法：选取2018年9月—2019年4月在浙江大学医学院附属儿童医院住院的117例病毒性肺炎患儿作为实验组,选取同期30例该院行健康体检儿童作为对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测外周血清miR-24mRNA,酶联免疫吸附试验测定血清YKL-40含量,潮气肺功能检测患儿达峰时间比(tPTEF/tE)。结果：与对照组相比,实验组血清miR-24mRNA相对表达量降低(P<0.05),而YKL-40含量升高(P<0.05)。重症肺炎患儿血清miR-24mRNA相对表达量较轻症患儿低,而YKL-40含量升高(P<0.05)。不同预后组治疗前后血清miR-24mRNA和YKL-40的差值比较,差异有统计学意义(P<0.05);迁延难愈组低于痊愈组和好转组(P<0.05),好转组低于痊愈组(P<0.05)。经Pearson相关性分析,治疗前患儿血清miR-24mRNA与YKL-40呈负相关(r=-0.297,P=0.000),与tPTEF/tE呈正相关(r=0.422,P=0.000);另外血清YKL-40与tPTEF/tE呈负相关(r=-0.394,P=0.000)。结论：血清miR-24mRNA和YKL-40表达水平在一定程度上可反映病毒性肺炎患儿病情严重程度、肺功能状况和治疗效果,可指导临床治疗。

关键词：
microRNA-24
YKL-40;肺功能
呼吸内科
肺炎病毒感染
重症肺炎
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感染性肺炎是儿科常见疾病,>50%患儿直接感染病毒或继发于支原体、细菌感染引起的病毒[1]。鉴于病毒性肺炎具有季节性的特点,例如流感病毒、新型冠状病毒、呼吸道合胞病毒等都可能引发大范围爆发和流行,严重危及儿童的生命健康。因此在治疗过程中,寻找有效的生物标志物用于评估病情进展、临床疗效和预后判断具有重要的临床意义。YKL-40属于一类典型的分泌型糖蛋白,与炎症反应密切相关,而且在肺部疾病的发生、发展过程中也发挥重要作用[2]。李智琼等学者[3]证实,YKL-40在支原体肺炎患儿血清中含量升高,并且可用于辅助诊断和评价病情严重程度及预后。KORTHAGEN等[4]也发现,肺泡灌洗液中YKL-40含量与肺纤维化患者预后呈负相关。但是其在病毒性肺炎患儿血清中的含量及临床意义未见学者关注。另外考虑到血清中很多蛋白分子的表达具有不稳定性,易被蛋白酶所降解,因此从上游水平寻找相关的microRNA(miRNA)作为检测指标。笔者通过在线生物学软件筛查发现,YKL-40编码基因CHI3L1是miR-24的下游靶基因[5],而且众多研究也证实,miR-24在炎症疾病中也属于功能性基因[6]。因此本实验拟研究浙江大学医学院附属儿童医院病毒性肺炎患儿血清miR-24、YKL-40与疾病严重程度、肺功能及预后的相关性,以期为指导临床诊断和个体化治疗提供理论依据,现报道如下。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取2018年9月—2019年4月在浙江大学医学院附属儿童医院住院的117例病毒性肺炎患儿作为实验组。其中,男性74例,女性43例;年龄2～11岁,平均(5.34±2.45)岁;流感病毒37例,呼吸道合胞病毒31例,副流感病毒19例,腺病毒12例,巨细胞病毒11例,EB病毒7例。纳入标准:①参考《儿童社区获得性肺炎管理指南(2013修订)》[7]关于病毒性肺炎和重症肺炎的诊断标准;②经血清分子生物学及直接免疫荧光法检测病毒特异性中和抗体;③所有重症肺炎患儿需经2位儿内科副主任及以上医师确诊;④由患儿法定监护人签署知情同意书。排除标准:①合并支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺栓塞;②急慢性炎症反应;③严重肝肾功能障碍;④免疫系统疾病;⑤先天性疾病;⑥反复呼吸道感染。根据不同预后分为痊愈组、好转租及迁延难愈组。另外选取同期本院健康体检儿童30例作为对照组。纳入标准:①年龄与纳入的病毒性肺炎患儿相匹配;②无基础性疾病;③近3个月内无呼吸道感染病史;④各项血常规指标和血生物化学指标均正常。本研究通过医院伦理委员会批准。

1.2主要仪器及试剂

Master Screen Paed型肺功能仪(德国耶格公司),One Step Prime Scriptc DNAS ynthesis Kit逆转录试剂盒和SYBR Premix Ex Taq TMⅡ试剂盒(日本TaKaRa公司),YKL-40ELISA试剂盒(美国R&D公司),利巴韦林注射液(马鞍山丰原制药有限公司,生产批号:20150114),阿奇霉素注射液(苏州长征-欣凯制药有限公司,生产批号:20150103)。

1.3治疗方法

所有患儿临床会诊后静脉滴注利巴韦林注射液10mg/kg,1次/d;合并细菌感染者静脉滴注阿奇霉素注射液(0.125g溶于250ml生理盐水)10mg/kg,1次/d,7d为1个疗程。另外给予退热、镇咳、祛痰等对症治疗,1～2个疗程后,采集晨起空腹血液标本。

1.4检测指标

1.4.1血清YKL-40

所有患儿入院就诊时第一时间采集肘静脉血6ml,静置20min,3000r/min离心20min,离心半径10cm,取上清,采用YKL-40ELISA试剂盒检测血清YKL-40含量。

1.4.2血清miR-24mRNA

采血方法同1.4.1,留取部分血清标本,加入Trizol试剂,提取血清总RNA,采用Thermo Fishermi RNA First-Strandc DNA Synthesis SuperMix试剂盒进行逆转录反应生成cDNA。采用SYBRGreen法行实时荧光定量聚合酶链反应,冰浴中配制10μlPCR反应体系:正反向引物各0.2μl、2×SYBRGreenIMsater5μl、cDNA模板1μl、适量去离子水。PCR反应条件:95℃预变性5min,95℃变性5s,63℃退火30s,72℃延伸30s,共计36个循环,从60℃缓慢升至97℃继续延伸并收集荧光信号,绘制熔解曲线。以小分子U6作为内参,以2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1PCR引物序列

1.4.3潮气呼吸肺功能

采血当日患儿口服5%水合氯醛或自然睡眠状态下,戴上合适面罩,采用MasterScreenPaed型肺功能仪检测患儿潮气呼吸肺功能,计算达峰时间比(tPTEF/tE),即到达呼气峰流速的时间与呼气时间之比。

1.5临床疗效评价标准

治愈:患儿临床症状消失,体温恢复正常,且胸部X射线检查显示肺部病灶完全消失;好转:患儿临床症状明显减轻,体温恢复正常,胸部X射线检查显示肺部病变基本或大部分吸收;无效:迁延难愈者或死亡者。总有效率(%)=(治愈+好转)/总例数×100%。

1.6统计学方法

数据分析采用SPSS17.0统计软件。计量资料以均数±标准差(x¯±s)表示,比较用t检或方差分析,进一步两两比较用LSD-t检验;相关性分析用Pearson法,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1病毒性肺炎患儿血清miR-24mRNA、YKL-40表达水平

对照组与实验组血清miR-24mRNA和YKL-40表达水平比较,经t检验,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组血清miR-24mRNA相对表达量较对照组低,而YKL-40含量较对照组高。见表2。

表2两组血清miR-24mRNA、YKL-40蛋白表达水平比较(x¯±s)

2.2不同临床病理特征患儿血清miR-24mRNA、YKL-40表达水平

不同年龄、性别、肺炎类型、病毒类型及是否合并细菌感染患儿血清miR-24mRNA和YKL-40表达水平比较,经t检验或方差分析,差异无统计学意义(P>0.05)。重症与轻症患儿血清miR-24mRNA和YKL-40表达水平比较,经t检验,差异有统计学意义(P<0.05),重症肺炎患儿血清miR-24mRNA相对表达量较低,而YKL-40含量较高。见表3。

表3不同临床病理特征患儿血清miR-24mRNA和YKL-40蛋白表达水平比较

2.3病毒性肺炎患儿的临床转归

经治疗后,73例患儿治愈出院,26例患儿出院时胸部X射线检查显示仍有极少部分病变未吸收,14例患儿迁延难愈,4例患儿死亡。

2.4病毒性肺炎患儿治疗前后血清miR-24mRNA、YKL-40表达水平的变化

病毒性肺炎患儿不同预后组治疗前后血清miR-24mRNA和YKL-40的差值比较,经方差分析,差异有统计学意义(P<0.05);迁延难愈组低于痊愈组和好转组(P<0.05),好转组低于痊愈组(P<0.05)。见表4。

表4不同预后患儿治疗前后血清miR-24mRNA和YKL-40的差值比较

2.5病毒性肺炎患儿治疗前血清miR-24mRNA、YKL-40与肺功能的相关性

经Pearson相关性分析,治疗前患儿外周血清miR-24mRNA与YKL-40呈负相关(r=-0.297,P=0.000),与tPTEF/tE呈正相关(r=0.422,P=0.000);另外血清YKL-40与tPTEF/tE呈负相关(r=-0.394,P=0.000)。见图1。

图1病毒性肺炎患儿治疗前血清miR-24mRNA、YKL-40与肺功能的相关性

3、讨论

儿童肺炎是各个地区儿童医院的常见疾病,尤其是在学龄前儿童中的致死率较高。本研究患儿经院内治疗后,4例死亡,均为<5岁儿童。病毒、细菌、支原体、衣原体、军团菌等是引起肺炎的主要病原体。相较于细菌和非典型性病原体,病毒感染与年龄、季节、地域关系密切,易爆发大面积流行。本研究主要纳入浙江大学医学院附属儿童医院冬、春季节发病的病毒性肺炎患儿,其中以流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒感染最多见。早期进行病原体检测可以为临床治疗提供可靠的依据。但是由于病毒性感染和细菌性感染多具有重叠性,临床症状不典型,依靠血常规、C反应蛋白、降钙素原等作为疾病诊断指标的特异性较低,更不适用于对疾病严重程度、临床疗效和预后的评估[8]。病毒性肺炎起病急、进展迅速、易引发并发症,寻找有价值的实验室监测指标用于反映疾病进展和疗效,具有十分重要的临床指导价值。

YKL-40是20年前由JOHANSEN等[9]发现的一类分泌型糖蛋白,由GHI3L1基因编码,属于GH18壳多糖酶家族成员。与其他GH18壳多糖酶蛋白分子不同,YKL-40仅具有壳质的结合位点,不具有壳质酶的生物学活性,反而在气道炎症性疾病进程中发挥着重要作用。GOMEZ等学者[10]发现,YKL-40在哮喘患者血清中的含量明显升高,并且与疾病进展有关。JAMES等学者[11]也发现慢性阻塞性肺疾病患者血清YKL-40含量也大大增加,并且可作为疾病严重程度、气道反应性及气流限制性的评估指标。YKL-40具有与细菌甲壳质酶高度同源性的氨基酸序列,可结合细菌的甲壳质酶,降解细菌细胞壁,进而抵御细菌入侵引起炎症反应[12]。目前临床关于YKL-40的大多数研究主要是针对细菌感染性炎症疾病,对病毒性肺炎的研究尚少。YKL-40属于炎症急性期蛋白,主要来自于活化的巨噬细胞和中性粒细胞。本研究发现,病毒性肺炎患儿血清YKL-40含量较健康儿童也明显增加;而且单纯病毒性肺炎患儿血清YKL-40含量与合并细菌感染患儿比较无差异,说明YKL-40可能不仅与细菌感染有关,而且是肺功能病变过程中的功能性因子。另外,由于YKL-40与C反应蛋白和降钙素原等因子类似,都属于非特异性急性时相反应蛋白,在感染早期即迅速升高,当感染被控制后又迅速降低,因此YKL-40并非是病毒性肺炎的特异性指标,但是在预测其疾病严重程度时具有一定的参考价值。

本研究还发现,重症肺炎患儿血清YKL-40含量升高更明显,而经抗病毒、抗感染等综合治疗后,治愈和好转患儿血清YKL-40含量显著降低,这也间接证实YKL-40可能通过某些因子的影响,参与肺组织功能损伤。TANG等[13]发现,YKL-40可以通过MAPK/NF-κB信号通路促进支气管上皮细胞表达白细胞介素-6、白细胞介素-8等促炎因子,并促进支气管平滑肌细胞的迁移和增殖活性。王定淼等学者[14]也证实,血清和肺泡灌洗液中YKL-40含量与重症肺炎患者病情严重程度密切相关,并且是影响患者预后的独立危险因素。本研究证实,血清YKL-40与患儿tPTEF/tE呈负相关。由于很多年龄较小的患儿往往不能配合肺功能检查,而且很多指标也不完全适用于儿童,因此采用潮气肺功能检查患儿tPTEF/tE,tPTEF/tE也是评估肺功能的良好指标之一。

除此以外,循环miRNA诊断标志物的筛查和挖掘一直是临床研究的热点。一方面循环miRNA多具有稳定的保守序列,操作方便,敏感性较高;另一方面,从作用网络分析,多数miRNA往往是编码蛋白基因的上游分子,其异常表达出现的时间往往早于蛋白分子,因此笔者通过miWalk、TargetScan6.2、PicTar等数据库预测miR-24和CHI3L1具有靶向调控关系。本研究中血清miR-24mRNA与YKL-40呈负相关,而且与患儿病情严重程度、肺功能及预后也有一定的关系。LIN等学者[15]通过脂多糖诱导新生大鼠肺损伤实验证实,血清miR-24在肺损伤大鼠模型中降低,而上调miR-24的表达可明显抑制肺部损伤和炎症因子的分泌,这与本研究结果一致。

综上所述,基于当前临床对病毒性肺炎疾病进展、临床疗效的评价主要依靠症状学依据,缺乏客观、量化的标志分子,本实验通过分析血清miR-24mRNA和YKL-40在不同临床病理特征及治疗前后表达水平的变化,证实两者与儿童病毒性肺炎有一定的联系。其中,血清miR-24mRNA与患儿肺功能指标tPTEF/tE呈正相关,而YKL-40与tPTEF/tE呈负相关。检测血清miR-24mRNA和YKL-40表达水平有助于评估病情和临床疗效,从而为临床治疗提供依据。

参考文献：

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[3]李智琼,孙承谋,朱玲娜,等.MP-IgM､YKL-40､APOC1和IL-6在儿童支原体肺炎治疗及预后中的意义[J].标记免疫分析与临床,2019,26(4):576-579.

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