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天花粉蛋白联合siPD-1促进卵巢癌细胞凋亡及机制研究

2021-12-04 39 上传者：管理员

摘要：目的:分析天花粉蛋白（TCS）、TCS和siPD-1联合用药对卵巢癌细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:将卵巢癌SKOV3细胞接种于6孔板（1×105个/孔）,并分为3组,空白对照组:12h后更换培养液,无任何药物处理,TCS处理组:12h后加入含不同浓度TCS（20、40、60、80、100μg/ml）的培养基,TCS+siPD-1联合处理组:12h后加入含不同浓度TCS（20、40、60、80、100μg/ml）和不同终浓度siPD-1（60、80、100、120、150nmol/L）的培养基,培养至24h、48h时收集细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,RT-PCR及ELISA检测凋亡相关信号表达及酶活性。结果:与空白对照组相比,TCS处理后的SKOV3细胞凋亡率显著提高,且呈时间和剂量依赖性（P<0.05）;与TCS处理组相比,TCS+siPD-1处理组细胞凋亡率显著上升（P<0.05）。不同浓度TCS处理组、TCS+siPD-1处理组细胞Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、Caspase-9mRNA表达上升,且呈时间和剂量依赖性（P<0.05）,TCS+siPD-1处理组Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、Caspase-9mRNA表达显著高于TCS处理组（P<0.05）。不同浓度TCS处理组、TCS+siPD-1处理组48h后,细胞Caspase-3酶活性显著上升,且呈剂量依赖性。结论:TCS和siPD-1联用可促进卵巢癌细胞凋亡,其机制可能为通过调节Caspase-3相关凋亡通路级联反应实现的。

关键词：
Caspase
siPD-1
卵巢癌
天花粉蛋白
细胞凋亡
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卵巢癌是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，隐匿性强，发现时往往已发生腹腔浸润和远处转移，患者五年生存率仅为35%。尽管当前医疗技术飞速发展，但卵巢癌患者发病及死亡情况均不容乐观。2015年中国癌症研究报告显示，卵巢癌年新增发病人数约为5.2万，年死亡人数达2.25万[1]。异质性是肿瘤最常见特征之一，也是导致卵巢癌治疗困难的重要因素[2]。基础研究及临床实践均表明卵巢癌发病诱因多样，多靶点药物联合治疗效果更为显著。

天花粉蛋白（trichosanthin,TCS）是从传统中药葫芦科植物栝楼块根中分离提纯的有效成分，是一种单链核糖体失活蛋白，具有RNAN-糖苷酶活性，具有较强的抗肿瘤活性[3,4]。大量研究证实TCS在多种肿瘤中发挥抑制作用，如在宫颈癌中，TCS可抑制癌细胞生长及增殖[5]；在非小细胞肺癌中，TCS可增强癌细胞对化疗药物的敏感性[6]；在卵巢癌中，TCS可促进癌细胞HO8910凋亡[7]。

程序性细胞死亡受体-1(programmedcelldeath-1,PD-1）是表达于免疫细胞表面的抑制性受体分子，通过与其配体PD-L1结合诱导已活化的T细胞凋亡，抑制T细胞活性，协助肿瘤细胞逃避机体免疫杀伤[8]。目前，PD-1抑制剂已成功开发，临床用于多种恶性肿瘤治疗，已取得较好疗效和安全性[9,10]。TCS和PD-1抑制剂均可抑制肿瘤细胞生长，但二者联合作用及机制尚未阐明。

本研究以卵巢癌细胞为研究对象，分析TCS和siPD-1对肿瘤细胞凋亡的影响及机制，同时考察TCS和siPD-1联用对卵巢癌的治疗效果，为卵巢癌治疗提供依据。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

人卵巢癌细胞株SKOV3购自中科院上海细胞所。

1.1.2 试剂

RPMI1640培养基、胎牛血清（FBS）购于美国Gibco公司；双抗（100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素）购于碧云天生物技术有限公司；TCS购于上海金山制药有限公司；转染试剂LipofectamineTM2000购于美国Invitrogen公司；siPD-1购于安徽通用生物技术有限公司；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于Roche;Trizol购于天根生化科技有限公司；PrimeScriptTMRTreagentKit购于TaKaRa;SunShineBioqPCRmixkit购于生兴生物有限公司；Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、Caspase-9、β-actin等引物由上海启因生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及处理

SKOV3采用RPMI1640培养基（含10%FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素）于37℃、5%CO2培养。胰酶消化对数生长期细胞，重悬，以1×105个/孔接种于6孔板，分为空白对照组：12h后更换培养液，无任何药物处理；TCS处理组：12h后加入含不同浓度（20、40、60、80、100μg/ml)TCS的培养基，各浓度设3个复孔；TCS+siPD-1联合处理组：12h后加入含不同浓度（20、40、60、80、100μg/ml)TCS和不同浓度（60、80、100、120、150nmol/L)siPD-1的培养基。siPD-1转染按转染试剂LipofectamineTM2000说明书进行：取设定摩尔浓度的siPD-1与无血清RPMI1640混合至25μl，取1μl转染试剂LipofectamineTM2000与无血清RP-MI1640混合至体积25μl，室温静置5min，充分混合得到转染物，室温静置20min，逐滴滴入预先准备好的细胞中，37℃、5%CO2孵育6h，更换含10%血清的RPMI1640培养基继续培养48h,1200r/min离心5min收集细胞，提取总RNA,RT-PCR检测PD-1基因敲减效率，各浓度设3个复孔。培养至24h、48h时分别收集3组细胞用于后续实验。

1.2.2 流式细胞术检测TCS、TCS/siPD1处理后卵巢癌细胞凋亡情况

按照AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明，采用不含EDTA的胰酶消化细胞，1000r/min离心5min，预冷PBS缓冲液洗涤细胞，1000r/min离心5min,PBS缓冲液重悬细胞制成细胞悬液（1×106个/ml），取100μl细胞悬液加入10μgAnnexinV轻轻混匀，室温反应15min，再加入5μlPI，避光室温孵育15min，加入400μlPBS缓冲液，1h内流式细胞仪检测。

1.2.3 RT-PCR检测SKOV3细胞Caspase-3级联相关凋亡分子mRNA表达

0.25%胰蛋白酶消化细胞，1000r/min离心5min，弃上清，PBS洗涤，1000r/min离心5min，弃上清，收集细胞沉淀。加入1mlTrizol溶液充分振荡混匀，室温静置5min使细胞充分裂解。每1mlTrizol加入0.2ml氯仿，盖好管盖剧烈振荡15s，室温静置3min。按Trizol试剂盒说明提取总RNA。根据PrimeScriptTMRTreagentKit说明配制反转录反应液，37℃5min,42℃60min,85℃5s，采用SunShineBioqPCRmixkit将反转录得到的cDNA进行扩增，扩增条件为：95℃2min热激活，95℃15s,60℃60s,40个循环。引物序列见表1。

1.2.4 Caspase-3酶活性检测

收集加药处理的细胞，裂解，按Caspase-3酶活性检测试剂盒说明书加入底物，检测吸光度值，得到Caspase-3酶活性。

1.3 统计学处理

采用SPSS22.0软件进行统计学分析，计量资料以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 TCS与siPD-1可诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡

与空白对照组相比，TCS处理后的卵巢癌SKOV3细胞凋亡率明显升高，且TCS处理组细胞凋亡率随TCS作用时间延长和浓度增加逐渐升高（P<0.05），表明TCS可诱导卵巢癌细胞SKOV3凋亡（图1A）。siPD-1单独处理SKOV3细胞也可促进其凋亡。siPD-1处理组细胞凋亡率随作用时间延长和浓度增加逐渐升高，当浓度100nmol/L时，与空白对照组差异具有统计学意义（图1B）。

2.2 TCS与siPD-1协同促进卵巢癌SKOV3细胞凋亡

空白对照组24h和48h凋亡率较低。加入TCS/siPD-124h后，不同浓度处理组凋亡率明显升高，48h凋亡率进一步升高。TCS+siPD-1对SKOV3细胞凋亡的影响呈剂量和时间依赖性。与TCS处理组相比，TCS+siPD-1处理组细胞凋亡率上升更为显著（P<0.05）。表明TCS可协同siPD-1促进卵巢癌细胞SKOV3凋亡（图1C）。

2.3 TCS和siPD-1协同促进SKOV3细胞Caspase级联分子mRNA表达

与空白对照组（PBS）相比，不同浓度TCS处理组、TCS/siPD-1处理组24h和48hSKOV3细胞Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、Caspase-9mRNA表达上升，且呈时间和剂量依赖性（P<0.05）。TCS+siPD-1处理组Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、Caspase-9mRNA表达显著高于TCS处理组（P<0.05）。提示TCS和siPD-1联用对Caspase-3相关凋亡基因表达影响更大（图2）。

2.4 TCS和siPD-1协同促进SKOV3细胞Caspase-3酶活性

不同浓度TCS处理48h,Caspase-3酶活性明显增强，且呈剂量依赖性。TCS/siPD-1处理48h,Caspase-3酶活性比TCS单独使用时显著增强。表明TCS协同siPD-1诱导Caspase-3酶活性（图3）。

3、讨论

卵巢癌是一类高发病率、高转移、高致死率的生殖系统恶性肿瘤，严重威胁女性生命安全[11]。手术辅以铂类药物为主的化疗是卵巢癌的传统治疗方法。但由于手术方法不成熟以及对铂类药物等化疗药物的耐药性，卵巢癌细胞极易发生侵袭和转移，导致患者预后不良[12,13,14]。因此，急需探索可改善卵巢癌预后的新药物和新的治疗方法。

近年来中药研究发现，多种传统中药含有具有明显抗肿瘤活性的有效成分[15]。TCS是从传统中药葫芦科植物栝楼块根中分离提纯的有效成分，是一种单链核糖体失活蛋白，具有RNAN-糖苷酶活性，具有抗菌抗病毒、增强免疫系统功能、终止妊娠等多种药理作用[16]。近年研究发现，TCS可通过竞争结合真核细胞28SrRNA核糖体抑制细胞蛋白合成，抑制肿瘤细胞增殖，促进其凋亡，具有较强的抗肿瘤活性[17]。TCS通过调节Notch信号通路表达抑制鼻咽癌细胞CNE2增殖，诱导CNE2凋亡[18]。胃癌中，TCS能够抑制胃癌细胞SGC7901磷酸化ERK表达，通过调节ERK信号通路诱导SGC7901细胞凋亡[19]。此外，TCS对黑色素瘤、宫颈癌、大肠癌、乳腺癌等均有明显抑制作用[20,21,22,23]。但TCS对卵巢癌的作用及分子机制研究较少。

PD-1是免疫球蛋白超家族成员，主要表达于活化的T淋巴细胞、B淋巴细胞及NK细胞表面[24]。肿瘤细胞表达PD-1配体，可与T淋巴细胞表面的PD-1结合，阻断P13K/Akt通路，诱导T淋巴细胞凋亡，使肿瘤细胞逃避T淋巴细胞杀伤，最终导致肿瘤细胞免疫抑制和逃逸[25,26]。近年PD-1已成为肿瘤免疫治疗靶点，PD-1抗体和抑制剂在多种恶性肿瘤治疗中已取得显著疗效，安全性较高[27,28]。此外，较多研究发现PD-1还表达于多个肿瘤细胞，且发挥不同作用，如在黑色素瘤中，激活PD-1/PD-L1信号可促进肿瘤生长，而在肺癌中，阻断PD-1信号可促进肿瘤细胞增殖[29,30]。因此，PD-1信号广泛参与肿瘤生长及增殖。本研究发现敲减PD-1分子后，卵巢癌SKOV-3细胞凋亡水平明显升高。提示PD-1在卵巢癌细胞中可能保护癌细胞免受PD-1介导的程序性凋亡作用。

本研究发现，TCS可诱导卵巢癌细胞SKOV3凋亡，且细胞凋亡率随TCS作用时间延长和浓度增加而逐渐升高（P<0.05）。与TCS处理组相比，TCS联合siPD-1处理组细胞凋亡率上升更为明显（P<0.05），且呈剂量和时间依赖性。进一步采用RT-PCR检测凋亡相关基因表达，结果显示TCS处理组、TCS联合siPD-1处理组细胞Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、Caspase-9mRNA表达均上升，表达水平随处理时间延长和药物浓度增加更为明显（P<0.05);TCS联合siPD-1处理组Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、Caspase-9mRNA表达明显高于TCS处理组（P<0.05）。此外，ELISA结果显示TCS处理组、TCS联合siPD-1处理组Caspase-3酶活性显著提高（P<0.05）。提示TCS协同siPD-1诱导卵巢癌细胞凋亡机制可能与促进Caspase-3酶活性、激活Caspase-3相关凋亡通路级联反应有关。

综上所述，TCS可诱导卵巢癌细胞凋亡，且与siPD-1联用具有协同促凋亡效应，TCS与siPD-1的协同效应可能通过调节Caspase-3相关凋亡通路级联反应实现。

参考文献:

[7]候贺佳,张爽天花粉蛋白对卵巢瘟HO8910细胞凋亡及Bax､Bc-2基因表达的影响[J].辽宁中医杂志,201389)1729-1730.

[16]冯果,陈娟,刘文,等.天花粉有效成分及药理活性研究进展[J].微量元素与健康研究,2015,32(6):59-62.

[1]邓心燕,杨玉,胡仁豪,等.天花粉蛋白抑制胃癌细胞生长及其分子机制研究[J].中国中西医结合杂志,2018,38(8)958-962.

[20]郭栋,韩冰冰.天花粉蛋白对黑色素瘤细胞黏附､迁移及侵袭能力的影响[J].辽宁中医杂志,2013,40(9):1932-1935.

文章来源：邹立君,胡律江.天花粉蛋白联合siPD-1促进卵巢癌细胞凋亡及机制研究[J].中国免疫学杂志,2021,37(24):2981-2985.