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PD-1溶瘤病毒对小鼠卵巢癌的抗肿瘤活性

2024-03-28 51 上传者：管理员

摘要：目的探讨程序性细胞死亡蛋白(PD)-1溶瘤病毒对卵巢癌的抗肿瘤活性。方法向C57BL/6J小鼠右前腋下注射人卵巢癌腺癌细胞系SKOV3构建卵巢癌小鼠模型，分别以不同滴度的PD-1溶瘤病毒，测量小鼠肿瘤体积，筛选最佳滴度。将构建好的卵巢癌模型小鼠随机分为模型组、PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组、PD-1溶瘤病毒组，每组16只。同时设置对照组16只。测定小鼠肿瘤体积、肿瘤质量；流式细胞术检测T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+、CD4+/CD8+;酶联免疫吸附法检测血清白细胞介素(IL)-2、IL-10、干扰素(IFN)-γ浓度；免疫组化法检测肿瘤组织中P53、Ki67阳性表达情况。结果不同PD-1溶瘤病毒滴度的卵巢癌小鼠肿瘤体积比较差异有统计学意义(P<0.01);随着PD-1溶瘤病毒滴度的升高肿瘤体积逐渐降低。当PD-1溶瘤病毒滴度达到5×107时卵巢癌小鼠肿瘤体积不再明显降低，与1×108时肿瘤体积之间比较差异无统计学意义(P>0.05),因此后续实验以PD-1溶瘤病毒滴度5×107处理卵巢癌小鼠。PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组、PD-1溶瘤病毒组肿瘤体积、肿瘤质量、CD8+、IL-10、P53、Ki67阳性率明显低于模型组，脾脏指数、胸腺指数、CD4+、CD4+/CD8+、IL-2、IFN-γ明显高于模型组(P<0.05);PD-1溶瘤病毒组脾脏指数、胸腺指数、CD4+、CD4+/CD8+、IL-2、IFN-γ水平明显高于PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组，肿瘤体积、肿瘤质量、CD8+、IL-10水平、P53、Ki67阳性率明显低于PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组(均P<0.05)。结论 PD-1溶瘤病毒能够明显改善免疫器官功能，激活免疫系统，提高抗肿瘤免疫活性；此外PD-1溶瘤病毒还可通过下调P53、Ki67表达来抑制卵巢癌的发展。

关键词：
免疫活性
卵巢癌
术后化疗
溶瘤病毒
程序性细胞死亡蛋白1
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卵巢癌发病初期无特异性症状，约2/3的患者就诊时已达到国际妇产科联盟(FIGO)分期Ⅲ～Ⅳ期，手术治疗效果不佳，需要联合术后化疗，对顺铂、紫杉醇等化疗药物耐药性增加时不良预后的主要原因之一[1]。程序性细胞死亡蛋白(PD)-1与其配体结合后能够抑制T细胞活性，诱发肿瘤免疫逃逸[2];PD-1抗体能够降低PD-1活性，提高免疫细胞的抗肿瘤作用；但由于PD-1抗体的组织穿透性较差，难以达到肿瘤病灶处，降低了其疗效[3]。溶瘤病毒具有抗癌作用的同时还能够增强活化T细胞浸润，与抗PD-1抗体结合后可提高其组织穿透性，增强抗肿瘤作用[4]。本研究探讨PD-1溶瘤病毒对卵巢癌的抗肿瘤活性。

1、材料与方法

1.1动物与主要试剂

SPF级雄性C57BL/6J小鼠，体质量(20±2)g,购于上海交通大学医学院实验动物中心，许可证号：SYXK(沪)2023-0007。人卵巢癌SKOV-3细胞株购于上海昆盟生物科技有限公司。PD-1、溶瘤单纯疱疹病毒(oHSV)购买以及PD-1溶瘤病毒构建由上海和元生物技术有限公司完成。DMEM细胞培养基、胎牛血清购于青岛捷世康生物科技有限公司；淋巴细胞分离液、PE标记小鼠抗人CD4单克隆抗体、PE标记小鼠抗人CD8单克隆抗体均购于天津梅德生物科技有限公司；酶联免疫检测试剂盒[白细胞介素(IL)-2、IL-10、干扰素(IFN)-γ]均购于仁捷(上海)生物科技有限公司；免疫组化(SP)检测试剂盒(P53、Ki67)购于北京拜尔迪生物技术有限公司。

1.2造模及PD-1溶瘤病毒最佳滴度筛选

复苏人卵巢癌SKOV-3细胞株后使用含胎牛血清的DMEM细胞培养基培养、传代，调整细胞密度为1×107/ml,向小鼠右前腋下注射0.2 ml细胞悬液，继续培养14 d后筛选出现移植瘤的小鼠进行后续研究。为筛选PD-1溶瘤病毒最佳滴度，分别将滴度为5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108的PD-1溶瘤病毒注射入卵巢癌肿瘤内部，每个滴度5只小鼠，同时设置5只小鼠为空白对照。每2 d注射1次，注射3次，末次注射结束后继续培养7 d,测量肿瘤长径、短径，计算卵巢癌肿瘤体积。

1.3分组与肿瘤体积测量

取卵巢癌造模成功的小鼠64只，随机分为模型组(静脉注射等量生理盐水),PD-1抗体组(静脉注射PD-1单克隆抗体，200μg),单独溶瘤病毒组(瘤内注射oHSV病毒，滴度5×107),PD-1溶瘤病毒组(瘤内注射PD-1溶瘤病毒，PD-1溶瘤病毒),每组16只。同时设置对照组(正常喂养的小鼠，静脉注射等量生理盐水)16只。每2 d注射1次，注射3次，末次注射结束后继续培养7 d,测量肿瘤长径、短径，计算卵巢癌肿瘤体积。

1.4标本采集与处理

测量完肿瘤长径、短径后麻醉小鼠并称重，腹主动脉取血后处死小鼠，剪下肿瘤组织并称重，记录肿瘤质量；取出脾脏、胸腺并称重，计算脾指数、胸腺指数。将收集的部分血液标本离心处理，-80℃保存待测；另外一部分血液标本放于适量的红细胞裂解液中，得到外周血T淋巴细胞，磷酸缓冲液重悬、混合均匀后计数备用。将肿瘤组织常规制成石蜡切片，用于免疫组化检测。

1.5各组小鼠T淋巴细胞亚群检测

取各组小鼠的外周血T淋巴细胞约1×107个，配制成500μl的细胞悬液，分别加入PE标记小鼠抗人CD4单克隆抗体、PE标记小鼠抗人CD8单克隆抗体后混合均匀，避光静置30 min,离心后弃去沉淀，磷酸缓冲液重悬后上流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群，记录CD4+、CD8+比例，计算CD4+/CD8+比值。

1.6各组小鼠血清IL-2、IL-10、IFN-γ浓度检测

取各组小鼠-80℃保存的血清样本，复温后吸出0.3 ml,按试剂盒说明书中的步骤，酶联免疫吸附法测定血清IL-2、IL-10、IFN-γ浓度。

1.7 SP法检测各组小鼠P53、Ki67表达检测

取肿瘤组织石蜡切片，烤片30 min,二甲苯浸泡后梯度浓度的酒精脱水，过氧化氢去除内源性过氧化物酶活性，修复抗原后封闭非特异性抗原；滴加一抗：鼠抗人P53单克隆抗体(1∶1 000倍稀释),鼠抗人Ki67单克隆抗体(1∶500倍稀释),鼠抗人β-actin单克隆抗体(1∶4 000倍稀释),室温下孵育1 h,滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗属IgG(1∶4 000倍稀释),显色、复染、脱水、透明后封片。显微镜下随机计数200个细胞，计算阳性细胞比例，根据阳性细胞比例和染色强度进行评分，使用两者的乘积判定结果，阴性(0分)、弱阳性(1～2分)、中等阳性(3～4分)、强阳性(>4分),将中等阳性和强阳性记为阳性。

1.8统计学分析

采用SPSS25.0软件进行χ2检验、方差分析，组间两两比较进行LSD-t检验。

2、结果

2.1不同滴度PD-1溶瘤病毒对肿瘤体积的影响

PD-1溶瘤病毒滴度0、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108时肿瘤体积依次为(308.51±12.80)、(269.83±15.65)、(236.24±11.97)、(213.69±9.41)、(189.47±8.29)、(173.59±7.85)、(171.06±8.53)mm3。不同PD-1溶瘤病毒滴度的卵巢癌小鼠之间肿瘤体积比较差异有统计学意义(F=30.958,P=0.000);随着PD-1溶瘤病毒滴度的升高肿瘤体积逐渐降低。当PD-1溶瘤病毒滴度达到5×107时卵巢癌小鼠肿瘤体积不再明显降低，与1×108时肿瘤体积之间比较差异无统计学意义(P>0.05),因此后续实验以PD-1溶瘤病毒滴度5×107处理卵巢癌小鼠。

2.2各组肿瘤体积、肿瘤质量比较

各组肿瘤体积、肿瘤质量比较差异有统计学意义(P<0.001);模型组肿瘤体积、肿瘤质量明显高于对照组(P<0.05),PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组、PD-1溶瘤病毒组肿瘤体积、肿瘤质量明显低于模型组，PD-1溶瘤病毒组肿瘤体积、肿瘤质量明显低于PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组(均P<0.05)。见表1。

2.3各组脾脏指数、胸腺指数水平比较

各组脾脏指数、胸腺指数比较差异均有统计学意义(P<0.05);模型组脾脏指数、胸腺指数明显低于对照组(P<0.05);PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组、PD-1溶瘤病毒组脾脏指数、胸腺指数明显高于模型组，PD-1溶瘤病毒组脾脏指数、胸腺指数明显高于PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组(P<0.05)。见表1。

2.4各组T淋巴细胞亚群比较

各组CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比较差异均有统计学意义(P<0.05);模型组CD4+、CD4+/CD8+明显低于对照组，CD8+明显高于对照组(P<0.05);PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组、PD-1溶瘤病毒组CD4+、CD4+/CD8+明显高于模型组，CD8+明显低于模型组(P<0.05);PD-1溶瘤病毒组CD4+、CD4+/CD8+明显高于PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组，CD8+明显低于PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组(P<0.05)。见表1。

表1各组肿瘤体积、肿瘤质量、脾脏指数、胸腺指数水平、T细胞浸润水平比较(n=16)

2.5各组血清IL-2、IL-10、IFN-γ水平比较

各组血清IL-2、IL-10、IFN-γ比较差异均有统计学意义(P<0.05);模型组血清IL-2、IFN-γ明显低于对照组，IL-10明显高于对照组(P<0.05);PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组、PD-1溶瘤病毒组血清IL-2、IFN-γ明显高于模型组，IL-10明显低于模型组；PD-1溶瘤病毒组血清IL-2、IFN-γ明显高于PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组，IL-10明显低于PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组(P<0.05)。见表2。

2.6各组P53、Ki67阳性表达比较

各组P53、Ki67阳性率比较差异均有统计学意义(P<0.05);模型组P53、Ki67阳性率明显高于对照组(P<0.05);PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组、PD-1溶瘤病毒组P53、Ki67阳性率明显低于模型组；PD-1溶瘤病毒组P53、Ki67阳性率明显低于PD-1抗体组、单独溶瘤病毒组(P<0.05)。见表2。

表2各组血清IL-2、IL-10、IFN-γ水平、P53、Ki67阳性表达比较

3、讨论

卵巢癌发病早期症状隐匿，诊断难度高，导致患者无法得到及时治疗、致死率高。相关研究显示，无盆腔淋巴结转移的卵巢癌患者5年生存率在40%左右，当出现盆腔淋巴结转移后患者的5年生存率下降至10%左右[5]。手术难以根治卵巢癌是患者不良预后的主要原因之一，需要联合术后化疗(顺铂、紫杉醇等),但耐药性发生率高，还可能引发外周免疫系统功能抑制[6];因此，探寻新的治疗手段对延长患者的生存时间具有重要意义。本研究结果提示，PD-1抗体、单独溶瘤病毒、PD-1溶瘤病毒干预均能够控制卵巢癌小鼠病情进展，其中PD-1溶瘤病毒效果最明显。

脾脏和胸腺在肿瘤免疫治疗中发挥重要作用，脾脏指数、胸腺指数减小会导致外周血白细胞比例下降、免疫功能减退，抗肿瘤活性降低[7,8]。T淋巴细胞主要包括CD4+、CD8+,在肿瘤免疫微环境中发挥抗肿瘤作用[9]。激活T淋巴细胞能够杀灭肿瘤相关的自身抗原，但多数恶性肿瘤患者无法自发激活抗原特异性T淋巴细胞[10]。IL-2与IFN-γ具有免疫效应细胞活性，能够提高人体的免疫功能，与免疫治疗效果密切相关[11]。IL-10具有免疫抑制作用，其高表达会降低肿瘤免疫治疗效果[12]。PD-1是免疫负调控因子，能够抑制免疫系统功能，降低免疫细胞对肿瘤的杀伤活性[13]。抗PD-1抗体能够抑制PD-1活性，提高免疫细胞的抗肿瘤作用。但单克隆PD-1抗体组织穿透力较弱，难以到达肿瘤病灶；溶瘤病毒组织穿透力强，在具有抗肿瘤活性的同时还可作为载体工具[14]。本研究中通过构建PD-1溶瘤病毒，明显提高了对卵巢癌的免疫调节作用，增强特异性抗肿瘤免疫细胞的杀伤能力，提高疗效。

P53基因是与人体肿瘤相关性最高的基因，引发肿瘤形成和恶性转化的P53蛋白是P53基因突变的产物，发挥肿瘤促进作用，会抵消野生型P53基因的抑癌作用[15]。相关研究显示，50%以上高恶性程度的浆液性卵巢癌组织中存在P53突变[16]。Ki67阳性表达于细胞核中，与核糖体转录相关，是评估肿瘤细胞活性的指标[17]。研究显示，Ki67代表有丝分裂指数，在G0静息期外的循环细胞中均有表达，肿瘤细胞增殖活性的提升说明恶性程度的增加[18]。本研究结果提示，PD-1溶瘤病毒可通过下调P53、Ki67表达来抑制卵巢癌的发展，且相比于单独PD-1抗体、溶瘤病毒作用更强。

参考文献:

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