卵巢癌作为妇科恶性肿瘤之一，发病率及致死率高，通常被发现时已为晚期。近年来药物发展使70%～80%晚期卵巢癌患者的病情得到有效缓解，然而仍有大部分患者复发[1,2,3]。化疗耐药是限制众多癌症治疗的一大关键。因此，研究卵巢癌化疗耐药对进一步的治疗至关重要。

微管蛋白作为紫杉醇靶向的主要蛋白与卵巢癌紫杉醇化疗耐药有着紧密联系[4,5]。目前研究发现，微管蛋白β(TUBB)3在肺癌、结肠癌等肿瘤组织中的表达量异常升高与紫杉醇耐药及较差的预后相关[6,7],可能是高表达的微管蛋白增加微管的动态不稳定性，也可能是不同亚型微管蛋白对紫杉醇的敏感差异性所致[8]。许多研究目前停留在阐述TUBB3表达与紫杉醇耐药的表观现象，然而对于TUBB3在肿瘤异常高表达的原因没有进一步的探索，有研究分析可能与DNA甲基化及组蛋白乙酰化修饰有联系。RE1沉默转录因子(REST)作为去乙酰化修饰酶通过对神经性基因转录调控在各种恶性肿瘤进程中发挥作用[9,10,11]。REST与某些基因的神经元限制性沉默元件结合去乙酰化组蛋白，随后基因启动子区域不能和转录因子或RNA聚合酶结合。目前已知有100多种含RE-1序列，并且受REST调控，其中包括TUBB3。本研究探探REST/TUBB3轴对卵巢癌紫杉醇化疗耐药性的影响及作用机制。

1、材料与方法

1.1 细胞系及试剂

人卵巢腺癌细胞SKOV3及SKOV3/tax(中国科学院肿瘤研究所);OVCAR3和OVCAR3/tax(中科院上海细胞库)。胰酶购自生工生物工程(上海)股份有限公司，胎牛血清购自Hyclone公司，总RNA提取试剂、逆转录试剂、定量聚合酶链反应(qPCR)试剂均购自湖南艾科瑞生物工程有限公司，qPCR引物由金唯智公司合成。4-苯基丁酸(PBA)、紫杉醇购自Medchemexpress公司，CCK8试剂盒购自Biosharp公司，细胞凋亡检测试剂盒购自BD公司，染色质免疫沉淀试剂盒购自Millipore公司，si-scramble-5FAM、si-REST-5FAM由吉凯生物科技有限公司负责合成，pd1-EGFP-N1-Control、pd1-EGFP-N1-REST由本实验室构建，Lipofectamine2000购自日本TaKaRa 公司，GAPDH、TUBB3、REST抗体均购自Abcam公司。羊抗鼠IgG二抗和羊抗兔IgG二抗均购自CST公司，acetyl-histone-H3、acetyl-histone-H4、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)1购自Biotech公司，电化学发光(ECL)试剂盒购自美国Millipore公司。

1.2 肿瘤组织来源

收集2019年6月至2021年6月于襄阳市中心医院(湖北文理学院附属医院)接受手术治疗的 40 例卵巢癌患者(紫杉醇敏感及耐药各20例),手术中切除肿瘤组织后立即冷冻保存于液氮中。临床标本经襄阳市中心医院伦理委员会审批通过，患者均知情同意。

1.3 细胞转染

细胞传代生长24 h后，胰酶消化、计数，贴壁培养24 h。使用Lipofectamine2000试剂分别转染pd1-EGFP-N1-Control、pd1-EGFP-N1-REST、si-scramble-5FAM、si-REST-5FAM等至靶细胞。

1.4 目的基因表达检测

Trizol法提取各组RNA,Nanodrop3000测定RNA的浓度，选取1 μg RNA逆转录成cDNA,构建 qPCR体系(20 μl):2 μl稀释后的逆转录产物、10 μl SYBR Green Mix、上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl、7.2 μl ddH2O。预变性95 ℃、5 min, 94℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸 1 min, 40个循环。通过2-ΔΔCt法计算目的基因表达量。选取GAPDH为内参对照基因，基因引物序列为：REST:正向TGATTACCTGGTCGGCAA,反向GACAATCATTGTCAACAGAAG;TUBB3:正向AATCCCATCACCATCTTCCAG,反向CCAGCATCGCCCCA CTTGA;GAPDH :正向ACATCGCTCAGACACCATG,反向：TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG。实验独立重复3次。

1.5 Western印迹

收集目标组别细胞，预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，胰酶消化2 min, 800 r/min离心4 min, 弃上清，PBS洗涤2次。加入全细胞裂解液于冰上裂解10 min。4 ℃,12 000 r/min离心10 min收集上清即为总蛋白。每组样品取30 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),湿转法进行目的蛋白转印，脱脂奶粉室温封闭2 h, 对应一抗过夜孵育；次日，PBST洗涤3次，二抗室温孵育2 h; 3次洗涤后进行显影成像。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡和周期

将对数生长期的各组细胞以10 000个/孔接种于24孔板，培养24 h后，分别以0.0、0.1、1.0、10.0、100.0 μg/L浓度的紫杉醇到各组细胞。紫杉醇处理24 h, 收集并 800 r/min离心5 min, 200 μl 结合缓冲液重悬细胞，加入4 μl膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素(Annexin Ⅴ-FITC)孵育15 min, 加入4 μl碘化丙啶(PI)混匀避光孵育5 min, 立即上机检测细胞凋亡。单染管PI和Annexin Ⅴ-FITC调节补偿。细胞周期检测需预冷的70%乙醇固定过夜，次日PBS洗涤2次，加入4 μl PI混匀避光孵育10 min, 随后上机检测。

1.7 CCK-8细胞增殖检测

严格参照CCK-8实验手册将适量细胞接种于96孔板中。分别以0.0、0.1、1.0、10.0、100.0 μg/L浓度的紫杉醇到各组细胞，设置6个平行孔作为重复。在细胞分别培养24 h时，每孔加入CCK-8溶液10 μl, 置于37 ℃细胞培养箱孵育2 h, 读取450 nm波长处吸光度。

1.8 ChIP-qPCR分析

严格参照实验手册进行操作。随后将染色质免疫沉淀得到的样品进行qPCR分析，引物序列(5′-3′)如下：TUBB3正向GCACCAAGGACAGCGCC,反向GCAACAAGAGCCAAACT CCATC;GAPDH正向CTAGTGTCCTGCTGCCCAC,反向AGGTCTTGAGGCCTGAGCTAC,采用标准曲线法定量ChIP DNAs。

1.9 免疫组化检测TUBB3和RSET表达

紫杉醇化疗敏感和化疗耐药卵巢癌患者肿瘤组织用固定剂(甲醇∶丙醇=1∶1)固定，切片和复水后用0.3%Triton X-100孵育。用anti-TUBB3和anti-REST抗体进行免疫组织化学检测。

1.10 统计学处理

采用SPSS20.0软件行非配对t检验、方差分析，使用GraphPad8.0软件绘制图表。

2、结 果

2.1 REST及TUBB3在紫杉醇化疗敏感/耐药卵巢癌组织及细胞系中的表达

与紫杉醇化疗敏感卵巢癌组织中REST、TUBB3表达(1.06±0.098、1.21±0.16)相比，紫杉醇化疗耐药卵巢癌组织中REST表达显著降低(0.32±0.095;t=9.320,P=0.001),TUBB3表达显著升高(2.13±0.190;t=-6.500,P=0.003)。Western印迹结果显示，相较于SKOV3和OVCAR3细胞，REST蛋白在其紫杉醇耐药细胞系SKOV3/tax、OVCAR3/tax中明显低表达，而SKOV3/tax、OVCAR3/tax中TUBB3蛋白表达明显高于SKOV3和OVCAR3细胞(P<0.05)。qPCR结果显示，在卵巢癌组织中，REST和TUBB3 mRNA表达水平呈显著负相关(r=-0.394 2,P=0.0061)。见表1、图1、图2、图3。

2.2 不同浓度紫杉醇对卵巢癌耐药细胞周期及REST、TUBB3蛋白表达的影响

细胞周期结果显示，随着紫杉醇浓度增加，SKOV3细胞及耐药细胞系SKOV3/tax周期阻滞在G2期的比例逐渐明显增高，且耐药细胞系SKOV3/tax从0.1 μg/L后，G2期比例显著低于SKOV3细胞(P<0.05)。同时OVCAR3、耐药细胞系OVCAR3/tax细胞G2期比例也逐渐明显增高，且耐药细胞系OVCAR3/tax从0.1 μg/L紫杉醇后，G2期比例显著低于OVCAR3细胞(P<0.05)。Western印迹结果显示，随着紫杉醇浓度递增，SKOV3和OVCAR3中REST蛋白表达逐渐明显减少，TUBB3表达逐渐明显增加，且呈明显剂量依赖性(均P<0.05)。见图4、表2、表3。

2.3 不同浓度紫杉醇对卵巢癌耐药细胞凋亡的影响

随着紫杉醇浓度升高，SKOV3细胞SKOV3/tax细胞系凋亡率逐渐明显增高，而耐药细胞系SKOV3/tax从0.1 μg/L起，凋亡率显著低于SKOV3细胞(P<0.05);OVCAR3细胞及耐药细胞系OVCAR3/tax凋亡率也逐渐明显升高，且耐药细胞系OVCAR3/tax从0.1 μg/L起，凋亡率显著低于OVCAR3细胞(P<0.05)。见表1、图5。

表1 不同细胞和细胞系TUBB3、REST蛋白表达及不同浓度紫杉醇对卵巢癌耐药细胞凋亡的影响

图1 REST及TUBB3在紫杉醇化疗敏感及耐药卵巢癌 组织中的表达(免疫组化染色，×200)

图2 Western印迹检测紫杉醇化疗敏感及耐药卵巢癌 细胞系中REST、TUBB3蛋白表达   

图3 REST及TUBB3 mRNA表达相关性   

图4 不同浓度紫杉醇对卵巢癌耐药细胞REST/TUBB3 蛋白表达的影响   

表2 不同浓度紫杉醇对卵巢癌耐药细胞G2期阻滞影响

表3 不同浓度紫杉醇对卵巢癌耐药细胞REST、TUBB3蛋白表达的影响

图5 不同浓度紫杉醇对卵巢癌耐药细胞系细胞凋亡的影响   

2.4 过表达REST增加卵巢癌耐药细胞化疗敏感性

CCK8实验结果显示，不同浓度紫杉醇作用于卵巢癌耐药细胞系SKOV3/tax时，从0.1 μg/L起，相较于REST过表达对照(OE-NC)组，REST过表达(OE-REST)组细胞活力水平显著降低(P<0.05)。细胞凋亡实验结果显示，OE-REST组SKOV3/tax细胞凋亡率显著高于OE-NC组(P<0.05)。细胞周期检测结果显示，在SKOV3/tax细胞中过表达REST,G2期细胞比例显著提高(P<0.05)。见表4。

表4 过表达REST对SKOV3/tax细胞增殖、凋亡和周期影响

2.5 REST通过组蛋白乙酰化修饰调控TUBB3的表达

相较于REST敲低对照(Si-NC)组，REST敲低(si-REST)组SKOV3和OVCAR3细胞中TUBB3蛋白表达显著升高(P<0.05),而OE-REST组SKOV3和OVCAR3细胞中TUBB3蛋白表达显著低于OE-NC组(P<0.05)。见图6、表5。当使用3 μmol/L PBA(PBA组)处理SKOV3和OVCAR3细胞24 h后，TUBB3基因及蛋白水平与未处理(NC)组比较均显著升高(P<0.05)。见表6、图7。ChIP实验结果显示，相较于si-NC组，si-REST组SKOV3细胞中TUBB3基因第2个甲基化位点富集到的H3-ac、H4-ac显著增多，而HADC1显著减少(P<0.05)。见表7。表明敲低REST或用PBA处理，可增强SKOV3和OVCAR3细胞中TUBB3 mRNA及蛋白表达；过表达REST可抑制SKOV3和OVCAR3细胞中TUBB3 mRNA及蛋白表达，敲低REST可使TUBB3基因上游调控序列结合更多的H3-ac、H4-ac从而促进TUBB3基因转录。

图6 Western印迹检测各组SKOV3和OVCAR3中 REST及TUBB3蛋白表达   

表5 各组SKOV3和OVCAR3细胞中REST及TUBB3蛋白表达

表6 PBA处理SKOV3、OVCAR3细胞后对TUBB3 mRNA及蛋白相对表达的影响

图7 Western印迹检测两组SKOV3和OVCAR3细胞中 TUBB3蛋白表达   

表7 SKOV3细胞中TUBB3甲基化位点富集指数

3、讨 论

TUBB3 在成熟神经元中高度表达，通常用作神经元分化的可靠标志物[7],在非神经细胞很少表达，但在几种非神经元肿瘤，如乳腺癌和肺癌中TUBB3异常高表达[6,9,12]。Dumontet等[13]发现，仅有22%的高表达TUBB3非小细胞肺癌患者对化疗敏感，然而低水平表达组患者敏感率高达60%。此外，在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌中TUBB3表达升高与紫杉醇耐药亦有紧密联系[7,12,13]。本研究结果表明，TUBB3高表达在促进卵巢癌紫杉醇化疗耐药过程中发挥重要作用。但这些非神经细胞中TUBB3异常高表达的原因却不清楚，这一始动因素是解决紫杉醇耐药性的关键所在。越来越多研究表明[14,15,16],表观遗传修饰的改变是肿瘤组织中基因失调的重要因素，其中DNA去甲基化、组蛋白乙酰化等修饰参与多种基因转录调节。TUBB3基因含有RE-1序列、受REST作用，提示在TUBB3异常升高介导的卵巢癌紫杉醇化疗耐药可能和REST有关联。组蛋白去乙酰化修饰蛋白REST通过神经性基因转录调控在成神经管细胞瘤中发挥促癌作用，在结肠癌、非小细胞肺癌中作为肿瘤抑制因子[17]。本研究结果表明，REST在卵巢癌中可能作为肿瘤抑制因子调控紫杉醇化疗敏感性。进一步研究表明，在不浓度紫杉醇作用下，SKOV3/tax耐药细胞系显示出比SKOV3和OVCAR3细胞更强的细胞凋亡抗性，G2期细胞比例显著降低，提示REST在紫杉醇耐药中的作用。

肿瘤化疗耐药性产生的原因多种多样，包括肿瘤补偿性信号通路的建立、靶蛋白的变化、肿瘤微环境的变化、肿瘤异质性和肿瘤对靶向药物的适应，多种耐药机制的共同作用促进了靶向耐药性的发展[18]。越来越多的研究将表观遗传修饰变化与化疗耐药联系起来，如有研究[19]揭示组蛋白去乙酰化酶 SIRT6在BRAFV600 突变体黑色素瘤对靶向丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号抑制剂(MAPKi) 耐药中的作用；有研究[20]发现，Zip介导的乳腺癌细胞他莫昔芬耐药的功能与其调控STAT3磷酸化的水平有关。本研究提示，REST通过组蛋白乙酰化修饰调控TUBB3表达。

综上，REST在卵巢癌紫杉醇耐药组织及细胞系中异常低表达，TUBB3在卵巢癌紫杉醇耐药组织及细胞系中异常高表达，两者mRNA表达呈负相关性，REST通过组蛋白乙酰化修饰调控TUBB3的异常高表达进而参与卵巢癌紫杉醇化疗耐药过程。

基金资助:北京市希思科临床肿瘤学研究基金会项目(Y-HS2019/2-071);襄阳市医疗卫生领域科技计划重点项目(2021YL10);

文章来源:余婷玉,方珊珊,朱言亮等.REST/TUBB3轴对卵巢癌紫杉醇化疗耐药性的影响及作用机制[J].中国老年学杂志,2024,44(05):1129-1135.