据世界卫生组织统计，全球每年有超过9 000万人感染沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,CT)和1.06亿人感染淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae,NG)[1]。解脲支原体(Ureaplasma urealyticum,UU)在非淋病性尿道炎(Non-gonococcal urethritis, NGU)中是仅次于CT的重要病原体[2]。CT是一种专性细胞内病原体，分为3个生物型，即小鼠生物型、沙眼生物型和性病淋巴肉芽肿生物型，其中沙眼生物型D-K血清型和性病淋巴肉芽肿生物型是引起泌尿生殖道疾病的主要病原体。NG为严格的人体寄生菌，常存在于急性尿道炎与阴道炎的脓性分泌物的白细胞中，无分型[3]。UU在人类泌尿生殖系统中属于常见的机会性致病菌，包含两个生物群共14个血清型，生物Ⅰ群包括1、3、6、14共4个血清型即微小脲原体(Ureaplasma parvum,UP),生物Ⅱ群包括2、5、9以及7-13共10个血清型即解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,UU)[4]。其中，UP是泌尿生殖道的正常定植菌群，致病机理尚未证实[5]。CT、NG和UU感染可导致男性尿道炎、前列腺炎和女性宫颈炎、不孕不育等疾病，有研究表明这三种病原体感染与女性流产、早产和宫颈癌密切相关，对人类健康造成极大的危害[6-7]。

在我国，常见CT、NG和UU混合感染，且往往表现为无症状感染，易延误病情或误诊误治[8]。因此，建立一种针对CT、NG和UU的快速准确的鉴定方法是非常必要的。目前对于CT、NG和UU的早期筛查和检测方法有三种：培养法、免疫学方法和实时荧光定量PCR法。但培养法灵敏度低，检测步骤繁琐；免疫学方法敏感性和特异性均较低[9-10];实时荧光PCR法(real-time PCR)灵敏度和特异性高，适用于多种临床样本类型，但需要较高的成本、专业实验室条件和操作人员能力[11]。以上方法均难以满足基层医疗机构对这类感染的检测和诊断需求。

本研究利用全自动检测设备及其配套的一体化微流控芯片，将核酸提取纯化和实时荧光PCR的流程整合，实现“样本进-结果出”的全自动化检测，建立了一种同时对CT、NG和UU实现现场化全自动核酸快速检测的方法。

一、材料与方法

1 材料

1.1 菌株、DNA及样本

CT、NG、UU阳性克隆菌株由北京中科生仪科技有限公司提供；CT、NG、UU以及单纯疱疹病毒Ⅰ型、Ⅱ型、肺炎衣原体、肺炎支原体、腺病毒脱氧核糖核酸液体室内质控品以及肠道病毒71型核糖核酸室内质控品均购自广州邦德盛生物科技有限公司；人免疫缺陷病毒Ⅰ型核糖核酸标准物质购自康彻思坦生物科技有限公司；粘蛋白购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；临床样本由山东第一医科大学第一附属医院(山东省千佛山医院)提供。

1.2 主要试剂

枯草芽孢杆菌菌株SCK6及枯草芽孢杆菌整合质粒pDG1730均购自北京宝赛生物科技有限公司；质粒提取试剂盒Gene-JET Plasmid Miniprep Kit为美国Thermo Scientific公司产品；PCR产物纯化试剂盒Min-Elute PCR Purification kit和核酸提取和纯化试剂盒QIA-amp®DNA Mini kit以及凝胶回收试剂盒QIA quick Gel Extraction Kit均为德国Qiagen公司产品；Air-DryableTMDirect DNA qPCR Stool为美国 Meridian 公司产品。对比试剂盒CT、NG、UU核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)为湖南圣湘生物科技有限公司产品。

1.3 主要仪器

手持式核酸快检一体机(P1000F)及配套微流控检测芯片由北京中科生仪科技有限公司研发。对比平台为美国赛默飞的ABi7500实时荧光定量PCR系统。

2 方法

2.1 引物和探针的设计与合成

登录NCBI查找UU 14个血清型的16S rRNA基因序列(NR_041710.1,NC_011374.1,NC_010503.1),使用Jalview软件进行比对后找到保守的序列片段，使用Primer Express 3.0软件对该保守序列设计UU的特异性引物及TaqMan探针。CT和NG特异的引物探针选取于文献中的序列，分别定位在CT的隐蔽性质粒和NG的porA基因上，并在CT-F和NG-F的序列上进行了优化。以上三组引物探针均在NCBI上进行了BLAST特异性比对。内部过程质控品(internal process control, IPC)为非天然序列。三种病原体和IPC的引物探针序列见表1。引物和探针均由百力格生物科技(上海)股份有限公司合成。

表1 CT、NG、UU和IPC引物及探针序列

2.2 阳性克隆菌株的制备

选取大小为500 bp的CT隐蔽性质粒、400 bp的NG porA和400 bp的UU 16S rRNA作为检测靶序列，使用全基因合成方法合成相应序列，以其为模板进行PCR扩增。PCR反应体系50 μL:Taq PCR Master Mix 12.5 μL,浓度为100 μmol/μL的上下游引物各0.2 μL,DNA模板1 μL,用DEPC水补足体积至50 μL。反应条件：95 ℃ 3 min; 98 ℃ 10 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 共35个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收PCR产物，纯化后连接到载体pDG1730质粒，连接产物转化感受态枯草芽孢杆菌；挑取阳性克隆菌，将其涂布在100 μg/mL壮观霉素抗性平板上，37 ℃倒置过夜培养；挑取单克隆菌进行PCR扩增，取产物进行2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并由北京擎科生物科技股份有限公司进行测序。鉴定正确的阳性克隆菌株通过显微镜计数法进行计数，并计算拷贝数。

2.3 现场化全自动检测设备及配套微流控芯片的制备

图1为手持式核酸快检一体机(P1000F)及其配套微流控芯片的示意图，微流控芯片构造包括试剂仓、管路层和密封层，其中试剂仓由样本仓、缓冲液仓以及洗涤仓构成，管路层由核酸提取纯化区、扩增区、废液区以及各功能区间的连接管路构成，密封层紧贴管路层中管路流道的表面，通过密封层封闭管路流道。整个芯片可形成一体化密闭系统，通过双泵配合驱动方式实现液路控制，即每个液路控制步骤由2个芯片内柱塞泵抽吸动作配合完成，无透气孔连通外界，避免样本或气溶胶泄漏污染等风险。PCR扩增试剂以及CT、NG、UU和IPC的引物探针通过风干技术预包埋在管路层的扩增区，IPC靶标的假病毒冻干球置于管路层样品管出口处，从样本纯化开始参与检测全过程。该检测系统可自动化进行核酸提取纯化、实时荧光PCR扩增以及结果判读全部过程。将200 μL拭子洗脱液样本加入微流控芯片的样本仓中，在P1000F设备上运行35 分钟即可直接读取检测结果和荧光扩增曲线。

图1 P1000F及配套微流控芯片示意图

2.4 检测范围及灵敏度实验

将CT、NG和UU阳性克隆菌株等比混合后作梯度稀释，直接加入微流控芯片中进行检测，测试检测范围和灵敏度。使用经数字PCR定量的阳性脱氧核糖核酸液体室内质控品在最低检测限浓度下进行灵敏度的验证。

2.5 特异性实验

通过全自动检测方法分别对单纯疱疹病毒Ⅰ型、Ⅱ型、腺病毒、肠道病毒71型、肺炎衣原体、肺炎支原体、以及人免疫缺陷病毒Ⅰ型的阳性质控品进行测试，分析检测方法的特异性。使用粘蛋白和血液测试干扰反应。

2.6 重复性实验

以阴性样本、灵敏度检出限样本(1×102copies/test)、略高于灵敏度的弱阳性样本(3×102copies/test)以及中等阳性样本(5×103copies/test)四种浓度的CT、NG和UU的混合阳性质控品分别加入微流控芯片中进行检测，重复6次，分析检测结果的重复性，并计算各浓度检测靶标Ct值的变异系数(CV)。

2.7 临床样本测试

用所建立的全自动检测方法与已上市多重检测试剂盒同时检测160例临床样本，评价所建立的全自动检测方法与已上市多重检测试剂盒的一致性，以验证本研究建立的全自动检测方法的临床可行性。

3 数据统计

使用软件SPSS 26.0对实际样本测试结果进行统计学分析，组间比较采用c2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1 阳性克隆菌株的制备和鉴定

将CT、NG和UU感受态枯草芽孢杆菌摇菌培养后，进行PCR扩增，取产物进行2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示CT、NG 及UU的扩增产物分别可见129 bp、89 bp和148 bp的特异条带，大小与预期一致(图2)。同时对重组阳性克隆菌进行测序，测序结果与NCBI上收录的CT、NG及UU相应序列完全一致，证明构建正确。通过显微镜计数对阳性克隆菌株进行计数，计算得CT、NG和UU浓度约为1×1010copies/mL。

图2 CT、NG和UU PCR扩增产物鉴定电泳图

2 全自动检测方法的检测范围

分别将CT、NG和UU的阳性克隆菌株等比例混合，10倍梯度稀释为5×102copies/mL、5×103copies/mL、5×104copies/mL、5×105copies/mL、5×106copies/mL和5×107copies/mL,取200 μL加入微流控芯片中进行检测；检测结果如图3A-3C所示，全自动检测方法可同时检测CT、NG和UU三种病原体，且每种病原体的检测范围均可达1×102～1×107copies/test, 灵敏度检出限均可达1×102copies/test。

图3 CT、NG和UU 全自动检测方法检测范围

3 全自动检测方法的灵敏度

将经数字PCR定量的CT、NG和UU的阳性脱氧核糖核酸液体室内质控品等比例混合后稀释到1×102copies/test, 用全自动检测方法重复测试十次，三种病原体和IPC均能稳定扩增(图4)。

图4 CT、NG和UU 全自动检测方法灵敏度

4 全自动检测方法的特异性

用全自动检测方法分别检测1×104copies/test的单纯疱疹病毒Ⅰ型、Ⅱ型、腺病毒、肠道病毒71型、肺炎衣原体、肺炎支原体、以及人免疫缺陷病毒Ⅰ型的阳性质控品，结果见表2。扩增结果均为阴性，说明无交叉反应。投入占总样本量5%(v/v)的粘蛋白和血液，全自动检测方法检测CT、NG、UU在粘蛋白和血液这两种干扰物质存在下可以稳定扩增。

表2 CT、NG和UU全自动检测方法特异性结果

表2 CT、NG和UU全自动检测方法特异性结果

5 全自动检测方法的重复性

将CT、NG、UU混合阳性质控品0、1×102、3×102、5×103copies/test四种浓度加入微流控芯片中进行检测，独立重复6次，如图6所示，三靶标均重复性良好。计算低、中、高浓度检测结果的变异系数，CT靶标三个浓度的变异系数分别为1.286%、1.425%、1.543;NG靶标三个浓度的变异系数分别为2.097%、1.101%、0.862%;UU靶标三个浓度的变异系数分别为0.885%、1.177%、2.528%。

6 全自动检测方法实际样本测试

测试结果显示，160例临床样本中，全自动检测方法对CT、NG和UU的阳性检出率分别为15.6%、10.6%和35.6%;双重感染患者的检出率为10.6%,其中CT+NG为1.3%,CT+UU 为8%,NG+UU为1.3%;未检测到三重感染的患者(表3)。全自动检测方法对 CT、NG和UU的阳性检出率与对比试剂盒相比，差异无统计学意义(χ2值分别为0.023、0.032、0.215;P均>0.05);其中阳性符合率分别为96.2%、94.4%和93.4%;阴性符合率均为100%;总符合率分别为99.4%、99.4%和97.5%(表4)。

图5 CT、NG和UU全自动检测方法重复性

表3 160份临床样本的检测结果

三、讨论

CT、NG和UU是性传播感染中最常见的几种病原体，可导致泌尿生殖道相关疾病，有研究表明这三种病原体感染与艾滋病和宫颈癌密切相关[6-7]。CT、NG和UU感染的临床症状没有明显差异，经常出现共同感染，且往往表现为无症状感染，易延误病情或传播疾病[8]。因此，临床上往往对这三种病原体同步进行检测。

表4 全自动检测方法与对比实时荧光方法检测160例临床样本的对比结果。

目前，临床上作为金标准的培养法灵敏度低，检测步骤繁琐；免疫学方法敏感性和特异性均较低[9-10];相对的，实时荧光PCR具有高灵敏、高特异的优点，适用于多种临床样本类型，目前被美国食品和药物管理局(U.S. Food and Drug Administration, FDA)推荐作为CT、NG和UU的检测方法。但实时荧光PCR法成本高、需配备专业的分子实验室和操作人员，且操作流程长，从样本收集、核酸提取纯化、配置PCR反应试剂到上机检测和结果判读，至少需要2～4 h[11-12],不能满足医院急诊、社区医院及乡镇诊所等场景现场快速检测的需求[14]。

目前已有针对CT、NG和UU的现场化快速检测方法，如基于抗原检测的免疫学方法，但其敏感性较低[15];一种基于环介导等温扩增技术的检测方法，可在1小时内同时检测CT和NG,但该方法需要手动进行核酸提取，不能完全实现现场化快速检测[16]。另一种检测方法基于微流控芯片技术，已经获得FDA批准上市[17],可检测拭子和尿液等多种样本类型，与基于实验室开展的实时荧光PCR相比，从样本投入到获得结果之前无需手动操作[18-19],但只能同时检测CT和NG两种病原体。

在本研究中，我们建立了基于微流控芯片的一体化全自动核酸快速检测方法，可在35分钟内同时检测CT、NG和UU。微流控芯片上集成磁珠法核酸提取纯化技术和金标准PCR扩增技术，可自动化完成核酸提取纯化、PCR扩增和结果判读。微流控芯片上预置全部反应试剂，包括纯化试剂、磁珠、风干PCR试剂等。全自动检测系统具有超声、泵阀、磁吸等模块，可全自动化完成样本裂解、核酸吸附、杂质洗涤和目的核酸洗脱等步骤，无需人工操作，实现了样本进、结果出的快速核酸检测。芯片为全封闭式设计，加样后检测过程在全封闭状态下完成，极大的避免污染和生物安全的风险。此外，该全自动核酸快速检测方法基于手持式核酸快检一体机，设备重量仅1 kg, 内置电池，便于携带，摆脱了核酸检测受环境制约的缺陷，这些均为现场快速检测的开展提供了更大的可行性。

本研究结果显示，该方法可同时检测CT、NG和UU且检出限可达到1×102copies/test, 检测范围可达1×102～1×107copies/test, 特异性和重复性良好。本研究检测的160例临床样本中，全自动检测方法对CT、NG和UU的检出率分别为15.6%、10.6%和35.6%;与多重实时荧光PCR检测结果比较，无明显差异(P>0.05);阳性符合率分别为96.2%、94.4%和93.4%,阴性符合率均为100%,总符合率分别为99.4%、99.4%和97.5%。综上所述，本研究初步建立了一种可同时检测CT、NG和UU的一体化全自动核酸快速检测方法，兼具实时荧光PCR高特异性和高灵敏性的优点，以及准确、快速、简便等可用于现场快速检测的特点，为CT、NG和UU的早期快速检测提供了一种新方法。

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基金资助:国家重点研发计划项目(No.2021YFC2401000);

文章来源:李雨欣,周华誉,张瑜,等.沙眼衣原体､淋球菌､解脲脲原体核酸快速检测方法的建立[J].中国病原生物学杂志,2025,20(02):158-163+170.