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论CS5100应用抗Xa活性测定肝素、低分子肝素及利伐沙班的性能验证

2020-05-28 514 上传者：管理员

摘要：目的评价CS5100全自动血凝仪(简称CS5100)应用抗Xa活性检测血浆肝素、低分子肝素(LMWH)水平及利伐沙班的性能验证。方法参照美国临床和实验室标准协会文件对CS5100应用抗Xa活性检测血浆肝素、LMWH及利伐沙班水平的精密度(批内精密度及日间精密度)、准确度、线性、参考区间、携带污染率性能进行验证。结果CS5100检测血浆肝素、LMWH及利伐沙班水平的批内精密度及日间精密度符合厂家说明书给定的标准；准确性验证结果偏倚在生物学变异系数(CV)要求内；应用试剂配套稀释液时血浆肝素水平的线性验证试验未达标；应用体检健康者血浆作稀释液时肝素、LMWH及利伐沙班水平的线性验证试验理论值和实测值的回归方程均符合要求；携带污染率各参数CV<10%；参考区间验证通过。结论CS5100检测血浆肝素、LMWH及利伐沙班水平的精密度、准确度、携带污染率、线性结果均符合质量控制要求，能够保证检验质量。但要注意检测结果超过线性时，要使用体检健康者血浆作稀释液手动上机检测。

关键词：
CS5100全自动血凝仪
低分子肝素
利伐沙班
性能验证
抗Xa活性测定
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随着肝素、低分子肝素（LMWH）及利伐沙班的广泛应用，对于部分患者的血浆肝素、LMWH及利伐沙班的药物水平进行必要的监测，可以在提高抗凝效果的同时降低患者出血的风险。CS5100全自动血凝仪（简称CS5100）应用发色底物法检测肝素抗Xa活性，其原理是将标本中的肝素等药物与抗凝血酶（AT）形成复合物，此复合物与过量添加的Xa因子相结合，并灭活与之结合的Xa活性。剩余的Xa因子活性的测量，是通过检测其特异的底物作用而释放出pNA的量来进行的，这一反应中最终检测到pNA的量与患者血液中肝素等药物的水平成反比，从而实现应用抗Xa活性定标血浆肝素、LMWH及利伐沙班水平。本文参考美国临床和实验室标准协会（CLSI)H57-A、H26-A2和EP17-A2文件、卫生行业标准WS/T406-2012及试剂生产厂家的试剂说明书作为依据[1,2,3,4,5]，对CS5100检测血浆肝素、LMWH及利伐沙班水平的性能进行验证。

1、资料与方法

1.1一般资料

随机选取在本院就诊的体检健康者，参照CLSIH21-A5文件的要求[6]，用0.109mmol/L枸橼酸钠抗凝管采集静脉血3mL,1500r/min离心10min，分离出乏血小板血浆，要求标本无溶血、凝固、乳糜现象，血细胞比容<55%。

1.2仪器与试剂

CS5100全自动血凝仪购自日本Sysmex公司；抗-Xa活性测定试剂盒（发色底物法）购自中国上海贞元诊断用品科技有限公司，批号为20181101。肝素校准品批号为20190201，质控品批号为20190201;LMWH校准品批号为20190301，质控品批号为20190301；利伐沙班校准品批号为20190301，质控品批号为20190301。

1.3方法

1.3.1精密度

以变异系数（CV）进行验证，批内不精密度：参考CLSIH57-A、H21-A5和试剂厂家的要求[1,6]，取2个水平的混合血浆，按照常规方法连续测定20次血浆肝素、LMWH及利伐沙班水平，计算各项目的x、s和CV。日间精密度：取2个水平的混合血浆，各分装成5份标本，保存于-70℃，每天测定4次，分2批测定，每批间隔时间2h，连续测定5d，记录每次测定结果，计算CV。按照厂家标准要求，肝素、LMWH及利伐沙班抗-Xa活性检测的批内精密度≤8%，日间精密度≤10%。

1.3.2准确度或可比性验证

参照厂家提供的定值质控品使用说明书，使用1mL的蒸馏水将正常和异常2个水平的定值质控品进行复溶、混匀，室温（25±2）℃稳定20～30min后进行检测。同时参照CLSIEP15-A2文件要求[7]，重复测定血浆肝素、LMWH及利伐沙班2个水平的定值质控品各3次，将测定值与靶值进行比较，计算相对偏倚，相对偏倚=（靶值-测定值）/靶值×100%。查阅Westgard生物学CV要求，偏倚±15%。

1.3.3线性验证

方式一：选取高水平LMWH的混合血浆，将高水平标本与试剂配套稀释液分别按5∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4、1∶9的比例混合，得到6份线性试验标本，每份稀释度重复测定3次，计算x。方式二：选取高水平肝素、LMWH、利伐沙班的混合血浆与未用药体检健康者的混合血浆，将高水平标本和体检健康者分别按5∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4、1∶9的比例混合，得到6份线性试验标本，每份稀释度重复测定3次，计算x。

判定标准：（1）肝素在0.10～1.20IU/mL线性范围内，线性相关系数（r）≥0.990；在0.10～0.25IU/mL线性范围内，线性绝对偏差不超过±0.05IU/mL；在0.26～1.20IU/mL线性范围内，线性绝对偏差不超过±15%。（2)LMWH在0.10～1.60IU/mL线性范围内，r≥0.990；在0.10～0.30IU/mL线性范围内，线性绝对偏差不超过±0.05IU/mL；在0.31～1.60IU/mL线性范围内，线性绝对偏差不超过±15%。（3）利伐沙班由于目前没有相关的要求，此标准参照肝素与LMWH定为线性绝对偏差不超过±15%。计算Y=aX+b，验证线性范围，a值在1±0.05范围内，r≥0.990。

1.3.4参考区间验证

厂家试剂说明书提供的参考区间肝素及LMWH均为0。参照CLSIC28-A2文件[8]，收集20名体检健康者血浆，排除伴有血液系统疾病、心脑血管疾病、肝脏疾病、肺栓塞、使用肝素等抗凝药物者。进行血浆肝素及LMWH水平的检测。评价标准：体检健康者血浆肝素及LMWH水平接近于0，结果符合率>90%。

1.3.5携带污染验证

参照CLSIH57-A文件[1]，高值标本污染，将低值标本置于1和3位置，高值标本置于2位置，每个标本测3次，记录结果，分别标注为L1、L2、L3、H1、H2、H3、L4。低值对高值的携带污染率=[H1-x(H1、H2、H3）]/x(H1、H2、H3），高值对低值的携带污染率=[L4-x(L1、L2、L3）]/x(L1、L2、L3）。尚未查到对抗Xa活性检测携带污染率有要求的指南性文件，仅有相关血凝仪性能验证文献[9,10]报道各项目CV<10%。因此，以携带污染率<10%为符合要求。

1.4统计学处理

采用Excel2003软件进行数据统计分析。

2、结果

2.1精密度验证

血浆肝素与LMWH水平批内不精密度和日间不精密度验证结果均符合试剂说明书要求。见表1。

表1肝素、LMWH、利伐沙班-抗Xa活性检测批内与日间精密度验证结果

2.2准确度验证

血浆肝素和LMWH各项目检测结果均落在质控品标示的允许范围内，偏倚符合Westgard生物学CV要求。见表2。

表2肝素、LMWH、利伐沙班抗Xa活性检测准确度验证

2.3线性验证

用试剂配套稀释液与高值混合血浆按比例稀释的LMWH线性验证其理论值与实测值的回归方程为Y=0.7495X+0.2529,r=0.984。不符合判定标准，验证不合格。用体检健康者混合血浆作稀释液与高值混合血浆按比例稀释的肝素线性验证其理论值与实测值的回归方程为Y=0.9961X+0.007,r=0.999；线性在0.10～0.25IU/mL时，线性偏差未超过±0.05IU/mL；在0.26～1.20IU/mL时，线性绝对偏差也均未超过±15%，均符合判定标准，验证合格。用体检健康者混合血浆作稀释液与高值混合血浆按比例稀释的LMWH线性验证其理论值与实测值的回归方程为Y=0.9823X+0.0174,r=0.996；线性在0.10～0.30IU/mL时，线性偏差未超过±0.05IU/mL；在0.30～1.60IU/mL时，线性绝对偏差均未超过±15%。均符合判定标准，验证合格。见表3。

表3肝素、LMWH、利伐沙班抗Xa活性检测的线性验证

2.4参考区间验证

20名体检健康者肝素、LMWH的血浆水平均为0.00IU/mL，结果通过率为100%。肝素为5.29IU/mL,s为0.11IU/mL;LMWH为5.30IU/mL,s为0.10IU/mL。

2.5携带污染试验

肝素高值对低值的污染所引起的相对偏差为2.17%，低值对高值的污染所引起的相对偏差为-4.50%。LMWH高值对低值的污染所引起的相对偏差为0.26%，低值对高值的污染所引起的相对偏差为-2.34%。携带污染率可接受。利伐沙班高值对低值的污染所引起的相对偏差为-0.30%，低值对高值的污染所引起的相对偏差为1.09%。见表4。

表4肝素、LMWH及利伐沙班高低值样本的携带污染率

3、讨论

肝素、LMWH及利伐沙班目前广泛用于治疗和预防各种血栓性疾病[11,12,13,14]。应用过程中，血栓出血等各类并发症也屡见不鲜[15,16]。目前，有研究和指南认为，对特定患者如年老者、肥胖者、孕妇、儿童和肾功不全患者的肝素、LMWH及利伐沙班进行血浆水平的监测，是提高抗凝效果、降低出血并发症的必要手段[17]。

本研究参考CLSI系列指南文件进行性能验证。结果显示血浆肝素、LMWH、利伐沙班水平的批内精密度和日间精密度均符合厂家要求（批内精密度应≤8%，日间精密度≤10%）。分别应用2个水平的定标血浆对血浆肝素、LMWH、利伐沙班水平的准确度进行验证，所有检测结果与定标值之间的偏差均小于±15%，符合厂家说明书的要求。

在线性范围验证中，以厂家配套稀释液与高值定标血浆混合的LMWHr不符合厂家说明书的要求，验证未通过。而用体检健康者混合血浆与高值定标血浆混合的血浆肝素、LMWH、利伐沙班r均符合厂家说明书的要求，验证通过。回顾原因可能是因为无论是肝素、LMWH还是利伐沙班，均在AT充足的条件下才能发挥抑制Xa因子活性，起到抗凝的作用。而本试剂盒的检测原理更是通过加入过量的Xa，来检测未被抑制活性的Xa数量，反过来推算血浆中的各种药物水平。当使用稀释液对高值血浆进行倍比稀释时，不能给试验补充相应的AT，造成检测的结果均低于理论值。体检健康者混合血浆在对高值血浆进行倍比稀释时，可以补充足够的AT，试验中各种药物可以被充分激活，所以检测值与理论值非常接近。尽管CS5100在血浆肝素、LMWH、利伐沙班的检测中自带各种倍数的稀释程序，但是需要使用稀释液进行稀释，检测结果无法反映真实的血浆水平，所以不能启用稀释程序。当血浆水平超过最大检出限时，要使用体检健康者混合血浆手工稀释后，进行上机检测。

参考区间验证中，20名体检健康者肝素、LMWH及利伐沙班的血浆水平均为0.00IU/mL，结果通过率为100%。携带污染也均低于相关血凝仪性能验证文献报道的各项目CV<10%[9,10]，符合要求。

4、结论

综上所述，本研究对CS5100全自动血凝仪进行肝素、LMWH及利伐沙班的血浆水平进行了性能验证，结果符合厂家和卫生行业标准的要求。但在应用时要注意要使用体检健康者血浆作为稀释血液进行线性的调整。同时，目前国内外对于通过测定抗Xa活性进行各种肝素类药物水平的检测，尚无性能验证和质量控制方面的指南性文件。期望相关指南的完善，能使肝素、LMWH及利伐沙班的血浆水平进一步规范化开展，提高检测质量。

参考文献：

[4]临床检验标准专业委员会.临床化学设备(下转第1225页)线性评价指南:WS/T408-2012[S].北京:中国标准出版社,2012.

[5]临床检验标准专业委员会.临床血液学检验常规项目分析质量要求:WS/T406-2012[S].北京:中国标准出版社,2012.

[9]王芳,张军,徐唯傑,等.SYSMEXCS5100全自动血凝分析仪的性能评价[J].检验医学,2015,30(2):177-180.

[10]闫宏斌,郑善銮,郝晓柯.SYSMEXCS5100血凝分析仪性能评估及凝血六项参考区间的调整[J].检验医学,2014,29(9):964-968.

付璐,李洁,董丽梅,毕莉,王颖,刘明明,李琳,吴悦,关雨.应用抗Xa活性测定肝素､低分子肝素及利伐沙班的性能验证[J].国际检验医学杂志,2020,41(10):1218-1221+1225.