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全基因组芯片检测在MDS诊断及预后中的应用

2021-06-04 351 上传者：管理员

摘要：目的:探讨全基因组芯片(SNP-A)检测在骨髓增生异常综合征(MDS)患者诊断方面的特异性、敏感性及预后中的应用价值。方法:对2019年09月到2020年04月期间我院诊治的20例初诊MDS患者，依据修订的国际预后积分系统(IPSS-R)对患者进行危险度分组，应用SNP-A对MDS患者进行全基因组范围DNA拷贝数的变异(CNV)和单亲二倍体(UPD)的检测，总结特点并与常规染色体核型分析(CCA)结果进行比较。结果:20例MDS患者染色体核型分析的异常检出率为40%,与SNP-A相结合染色体异常的检出率提高至65%,二者比较差异有统计学意义(P<0.05);低危组和高危组患者核型异常的检出率分别为15%和25%,与SNP-A相结合异常检出率分别提高至30%和35%(P<0.05);SNP-A检测出CNV和UPD高危组患者均明显高于低危组患者(P<0.01)。结论:SNP-A与CCA的联合使用，大大提高了MDS患者染色体变异的检出率，并且SNP-A能够对MDS患者提供更多更全面的遗传学信息，对于疾病的诊断和预后有重要价值。

关键词：
基因组芯片
染色体变异
染色体核型
骨髓增生异常综合征
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骨髓增生异常综合征(MDS)是一类起源于造血干/祖细胞水平损伤而产生的获得性克隆性髓系肿瘤，其发病机制主要涉及遗传学异常、免疫调节、骨髓微环境改变等，其临床特征为无效造血、造血衰竭以及向急性髓细胞白血病转化的趋势。目前MDS的发病机制尚不明确，骨髓细胞分子遗传学改变作为克隆性病变的证据，在MDS的诊断、预后和治疗中有着独立的指导价值,受到临床的广泛关注。然而，传统的染色体核型分析(ACC)由于其检测分辨率低、依赖于中期分裂细胞或只能进行特定位点检测，降低了检出的阳性率。单核苷酸多态性芯片(singlenucleotidepolymorphasimarray,SNP-A)则可对MDS患者的拷贝数变异(copynumbervariation,CNV)和单亲二倍体(uniparentaldisomy,UPD)进行全基因组高通量检测，不仅可以提高染色体变异的检出率，而且能够提供更多基因组学相关信息，对于MDS疾病的诊断和预后具有重要意义。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取2019年09月至2020年04月在我院血液科收治的初诊为MDS的患者20例，男12例，女8例，年龄26～82岁，平均(58.7±16)岁。均根据MDS最低诊断标准(维也纳，2006)和WHO2016MDS分型诊断标准明确诊断，依据2012年修订的国际预后积分系统(InternationalPrognositicScoring,IPSS-R)(表1)。20例患者分为高危组10例，低危组10例。

表1骨髓增生异常综合征国际预后积分系统

1.2研究方法

1.2.1G显带技术

取新鲜骨髓液(肝素抗凝)5mL,按MNC2×106/mL接种于培养基中，采用短期培养法制备染色体标本，并使用G显带技术对15～20个中期细胞进行核型分析。染色体核型依据ISCN2013进行描述。

1.2.2SNP

Array收集患者骨髓液，利用QIAampDNAMiniKit(QIAGEN,USA)试剂盒提取基因组DNA,经PCR扩增、纯化、标记、杂交、洗染后采用CytoScan750K芯片(Affymetrix,USA)扫描，结果使用ChAs分析，染色体异常描述依据ISCN2013进行。

1.3统计学处理

采用SPSS11.5统计软件分析，定量资料用配对样本t检验进行分析，率的比较采用卡方检验进行分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1SNP-A检测MDS患者染色体CNV及UPD的数量分布

SNP-A检测本组MDS患者染色体异常结果如下：拷贝数扩增17处，缺失20处，UPD最多，共计47处。分组比较的结果显示：高危组患者的CNV及UPD异常数目均高于低危组患者，比较差异具有统计学意义(P<0.01)(表2),表明SNP-A检测在MDS危险度分层中有指导价值。20例患者中有16例患者有染色体核型结果，而SNP-A检测出84处有价值的染色体异常，部分异常准确定位于恶性血液疾病相关的受累基因。

2.2SNP-A与常规染色体核型比较额外异常的检出率

对20例MDS患者应用常规核型分析，结果正常8例(40%),结果异常8例(40%),核型分析失败4例(20%),低危MDS和高危MDS常规核型异常的检出率分别为15%和25%。常规核型分析与SNP-A检测相结合，20例患者中有13例(65%)检测到染色体异常，与单纯常规核型分析比较，二者差异具有统计学意义(P<0.05),且低危和高危染色体异常检出率分别提高至30%和35%,提示两种检测技术相结合可提高MDS患者染色体异常的检出率。20例患者中有4例常规核型分析失败，其中3例(75%)应用SNP-A检测到染色体异常。应用SNP-A技术检测到核型正常的8例患者中3例(37.5%)有额外的染色体异常，核型异常的8例患者中5例(62.5%)有额外异常(表3)。

表2MDS患者不同分组SNP芯片异常数量

2.3SNP-A检测MDS患者染色体异常的分布情况

本组实验20例MDS患者SNP-A检测到的染色体异常分布如图1所示，20例MDS患者中4例为Gain/GainMosaic(8);3例为LossMosaic(7)、LossMosaic(20q)、LossMosaic(5q)均为髓系恶性血液疾病，特别是MDS患者的常见染色体异常；3例为Gain/GainMosaic(21q)在CMML、MDS和AML患者中有报道；2例为LossMosaic(15q)、LossMosaic(3);1例Gain(1p)、UPD(17p)在MDS和AML患者中有报道；1例GainMosaic(12)被认为是与恶性血液疾病相关的病理性改变，在RAEB-2患者中有报道；UPD(8q)在RA患者中有报道；UPD(6p)、UPD(11q)被认为是与恶性血液疾病相关的获得性改变，在CMML、MDS、MDS/MPN和sAML等疾病患者中有报道。以上染色体异常均经数据库检索和相关文献支持[2,3]。

表3常规核型与SNP-A芯片结果比较

检测过程中发现意义不明确的CNV及UPD异常如图2分布，拷贝数扩增见于Y、21号染色体，缺失见于4号染色体，UPD常见于X、19、2、6、3、7、17号染色体，特别是X染色体，见有大量意义不明的UPD分布，与文献报道一致[2]。其中一名患者的胚系细胞中检测出的大部分染色体异常均为UPD,高达22处，提示该患者父母可能为近亲关系，进一步遗传咨询证实患者父母为3级亲属。

3、讨论

MDS是由于全潜能干细胞水平上的恶性病变所致分化障碍的一组克隆性、异质性造血干细胞疾病，作为一种信息度不定的典型“灰区病”,其诊断分型一直是世界性难题。随着对MDS疾病的认识不断深入，细胞遗传学在MDS诊治中的价值日渐突出。1997年提出的国际预后积分系统(IPSS)将染色体核型纳入预后指标，首次提出了染色体与预后的关系。2003年英国学者提出MDS诊断和治疗指南，指出MDS的最低形态学诊断标准尚不存在，凡疑似MDS者均须行细胞遗传学检测。2006年MDS国际工作组提出的维也纳最低诊断标准正式将典型的染色体核型异常列为3个确诊条件之一。2012年提出修订的IPSS(IPSS-R)更是细化了染色体核型异常在疾病危险度分层中的价值。因此获取全面精准的细胞遗传学的信息对MDS的诊断、判断预后至关重要。

图1SNP-A检测MDS患者的染色体异常的分布情况

图2SNP-A检测意义不明确的CNV及UPD异常分布

MDS染色体水平既往主要采用常规G显带核型分析和荧光原位杂交(FISH)技术进行检测。早期的指南均以常规细胞遗传学分析(CCA)作为标准，可检测到包括平衡易位在内的多种染色体的异常，但此种方法只能分析中期细胞，常因有丝分裂指数低致检测阳性率偏低，耗时长，操作繁琐复杂。FISH技术只能用特异性的探针检测已知的染色体异常，不能对全基因组信息进行评估。随着基因芯片技术的兴起，SNP-A作为MDS的细胞遗传学检测的重要技术之一在多数指南中被提出[4]。SNP-A芯片经过高通量检测DNA基因组中的单个核苷酸多态性位点，既能够检测到DNA拷贝数的异常，还能够检测到杂合性缺失(LOH)和低水平的嵌合体(Mosaic)[5]。

研究表明，细胞遗传学以及分子遗传学的改变对于MDS疾病诊断和预后具有十分重要的作用，甚至SNP-A发现的染色体额外异常是MDS患者总生存及无事件生存的独立预后因素[6]。40%～60%的原发性MDS患者和90%的治疗相关性MDS患者可检出非随机分布的染色体异常[7],大多为大片段缺失、多位点破坏及染色体数量的异常，应用SNP-A可以检测到除平衡易位外的以上所有染色体异常，而且能进一步提供CNV及UPD的异常。故SNP-A突显出其优势，可发现CCA或FISH方法不能检测到细小及复杂的基因组变化[8],提高检测的分辨率。本研究中的20例MDS患者，高危组CNV及UPD异常的数目均高于低危组患者，两组有明显差异(P<0.01),与常规染色体核型分析相结合，染色体异常的检出率均明显提高，与文献报道一致[9]。

MDS的常见染色体异常并不随机，包括-7/7q-、-5/5q-、i(17q)/t(17p)、-13/13q-、11q-、12p-/t(12p)、9q-、idic(X)(q13)、t(11;16)(q23;p13.3)、t(3;21)(q26.2;q22.1)、t(1;3)(p36.3;q21.2)、t(2;11)(p21;q23)、inv(3)(q21;q26.2)和t(6;9)(p23;q34)[8]。部分异常具有特异性诊断价值，而+8、20q-和-Y亦可见于再生障碍性贫血及其他非克隆性血细胞减少疾病。本研究应用SNP-A检测到的染色体CNV及UPD的异常同样呈非随机分布，5、7、8、20号染色体的异常为重现性异常，结果与常规核型检测的结果一致。且SNP-A的检测结果还显示了其他重现性异常：扩增常见于1、14、21、12号染色体，缺失常见于3、15、17、18号染色体。有文献报道，MDS染色体异常以-7/7q-、+8、17P-、-18/18P-、20q-和+21q为多见[10]。本研究结果与之一致。另外，在SNP-A的检测过程中发现部分意义不明确的CNV及UPD,扩增见于Y、21号染色体，缺失见于4号染色体，UPD常见于X、19、2、6、7、17号染色体，特别是X染色体，见有大量意义不明的UPD分布。这些临床意义不明确的基因异常比较大或者为嵌合体且包含血液病相关的受累基因的染色体异常，可能为恶性血液疾病的相关异常，不同的临床实验室可能有不同的诠释[11],需进一步扩大样本进行总结观察，临床中这部分患者应密切关注及随访。研究发现很多核型正常的MDS患者疾病的转归存在明显差异[12],SNP-A检出的隐匿性变异对这种差异做出了解释，并对临床生存率的分组研究具有指导意义[5]。

虽然在MDS患者中杂合性缺失(LOH)已经有见报道，但缺乏足够的数据表明其在MDS疾病发生和发展过程有何种重要的作用，有研究指出可能与抑癌基因缺失或癌基因扩增相关[13]。UPD表示所检测区域染色体拷贝数正常，但是所检测区域的基因均为纯合状态。这种大片段纯合可能来自于遗传，如近亲结婚，增加了某些常染色体隐性遗传疾病的发生风险，而在大多数肿瘤性病变中为后天获得，约20%的MDS都表现为UPD,常见如：UPD1p、UPD4q、UPD7q、UPD9p、UPD11q、UPD17p、UPD21q等，这些UPD异常多伴有相关基因的纯合突变，如：NRAS(1p)、MPL(1p)、TET2(4q)、EZH2(7q)、JAK2(9p)、CBL(11q)、TP53(17p)、RUNX1(21q)等。获得性UPD导致MDS发生常见的染色体畸变，研究其定位的受累基因对于确定新的突变靶点十分重要，进而影响MDS的发生和治疗效果[14]。本文的20例MDS患者中，UPD发生的数量最多，且高危组患者UPD的发生率明显高于低危组患者，提示UPD的发生可能是MDS患者的预后不良因素之一。有报道UPD17p中有纯合的TP53突变，多见于高危MDS患者，向AML转化的风险大[15]。本组研究中1例核型正常患者检测到UPD(17p)额外异常，观察其治疗转归较差，且短期内转为急性白血病，与文献报道一致。近年来发现基因突变与MDS的疾病进展显著相关[16]。研究表明约1/3的MDS患者携带体细胞突变，其中有部分基因的改变对MDS的临床表征和生物学特性有较强的关联，包括血细胞减少、原始细胞数量、细胞遗传学表现和总生存期等[17]。应用全基因组SNP-A检测筛查染色体的异常，进而在异常部位进行基因突变的检测可以提高检测效率，甚至可以发现新的基因突变的位点，为MDS临床诊断、治疗及预后判断提供依据[18]。

综上所述，SNP-A对常规细胞染色体分析阴性或无法获得分裂象的患者能够发现具有临床意义的染色体异常，而且较常规染色体核型分析能够提供更全面、更多的细胞遗传学信息，对于MDS的疾病诊断及预后判断乃至于发病分子机制的阐明和临床表型异质性的解释具有重要意义。

文章来源：李叶琼,冶秀鹏,宋丽君,马燕萍,张伟,李蓉,包慎,白洁,李芳.全基因组芯片检测在MDS诊断及预后中的应用[J].现代肿瘤医学,2021,29(13):2313-2317.

基金：宁夏自然科学基金项目(编号:2018AAC03174);宁夏人民医院振兴培育项目(编号:201920)