SMZ属于磺胺类抗生素(SAs)中的一种，其抗菌谱广，抗菌作用强，临床上广泛用于抗感染治疗；同时，由于其价格低廉，性质稳定，又被广泛用于畜牧业和水产养殖业，用以预防或治疗细菌感染，但其残留问题又会引发食品安全问题和环境污染风险[1]。目前，SMZ的检测方法极大的依赖于色谱和质谱这类大型仪器，尽管这些方法选择性好、灵敏度高，但仪器昂贵，检测成本高，且前处理复杂，十分耗时，很难在现场快速分析。因此，发展低成本、快速、灵敏且便捷的检测方法具有十分重要的现实意义。

荧光分析法具有灵敏度高、信号丰富、材料丰富、检测成本低及设备简单等优点，可以实现简单便捷、低成本、快速、超灵敏等快速检测。Dong等[2]报道了一种以水相合成的CdTe量子点为荧光探针，基于荧光内滤效应建立了一种定量检测SAs的简单、快速的荧光分析方法。Chen等[3]构建了一种以蓝色发射CDs为标准信号、红色发射CdTe量子点为响应信号的荧光探针，通过肉眼方便地检测了牛奶中的磺胺二甲嘧啶。然而，荧光分析法不具备分离能力，对于与目标分析物具有相似结构和性质的物质难以有效区分。而SAs结构类似，有共同的母体对氨基苯磺酰胺，这些类似物对荧光检测有一定干扰作用。

分子印迹技术(MIT)通过形成一个在空间结构和官能团上都与模板分子(目标物)相匹配的具有特异功能的空腔[4],模拟酶-底物或抗体-抗原之间的相互作用，可实现对复杂样品中目标物的特异定向识别。

基于此，本研究以CDs为荧光信号，SMZ为模板分子，APTES为功能单体、TEOS为交联剂，构建高选择性的荧光传感器CDs@MIP(图1)。利用SMZ能淬灭CDs@MIP荧光强度的原理，探究高选择性、超灵敏识别SMZ的方法，期望能实现对尿液和血清中SMZ的高效、超灵敏检测，为发展简单、高效、低成本、便捷的SMZ检测方法提供实验依据。

图1 实验流程机理图  

1、材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品与试剂

SMZ(CAS:723-46-6)、磺胺嘧啶(SD,CAS:68-35-9)、磺胺甲基嘧啶(SM,CAS:127-79-7)、磺胺二甲嘧啶(SM2,CAS:122-11-2)、磺胺噻唑(STZ,CAS:72-14-0)、磺胺二甲异恶唑(SFZ,CAS:127-69-5)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM,CAS:1220-83-3)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM,CAS:122-11-2)、磺胺醋酰(SAC,CAS:144-80-9)、磺胺甲氧哒嗪(SMP,CAS:80-35-3)、谷胱甘肽(GSH,CAS:70-18-8)、谷氨酸(Glu, CAS:3929-61-1)、L-半胱氨酸(Cys, CAS:52-90-4)、APTES(CAS:919-30-2)、TEOS(CAS:78-10-4),上述试剂均从上海阿拉丁试剂有限公司购得；柠檬酸、尿素、无水乙醇、甲醇、氢氧化钠(NaOH)、石油醚(60～90℃)、氢氧化铵(NH4OH),氟化铵(NH4F)、二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠，上述试剂均从国药集团化学试剂有限公司购得，均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.1.2 设备与仪器

Spectrum Two型傅里叶红外光谱仪(铂金埃尔默股份有限公司);Tecnai G2 F20型场发射透射电子显微镜(美国FEI公司);GeminiSEM 300型蔡司场发射扫描电子显微镜(德国蔡司);XRD-6100型X射线衍射仪(岛津国际贸易有限公司);K-Alpha型X射线光电子能谱仪(美国Thermo Scientific公司);TDL-5A型台式低速离心机(常州峥嵘仪器有限公司);F96pro型荧光分光光度计(上海棱光技术有限公司);UV1901型紫外可见分光光度计(上海奥析科学仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 CDs@MIP的合成

(1)氨基化CDs合成。

氨基化CDs相比于普通CDs更容易与二氧化硅基质作用，其合成方法为[5]:取0.21g的柠檬酸和0.1g的尿素，超声并溶解在25mL的去离子水中。然后在180℃的烘箱中反应4h。反应完成后用1mol/L的NaOH溶液将pH调至7。取上述CDs溶液7mL,加入0.5mL APTES,混合均匀后在40℃的水浴中反应30min, 冷却后用石油醚对氨基化的CDs进行沉淀纯化，并将纯化后的CDs分散在乙醇中。

(2)CDs@MIP合成。

通过溶胶-凝胶聚合法制备CDs@MIP[6]:取0.025g的SMZ溶解在5mL的无水乙醇，向上述混合液中加入12mL的氨基化CDs溶液(体积比为1∶1),2.4mL TEOS,3.6mL APTES;在搅拌状态下加入0.6mL催化溶液(2g NH4F、23mL NH4OH溶解在100mL水中);在25℃下搅拌30min。离心收集产物，用无水乙醇清洗产物除去多余杂质，并用甲醇反复超声洗脱至上清液检测不出SMZ,烘箱干燥，制得CDs@MIP。非分子印迹聚合物(CDs@NIP)不加模板分子SMZ,其余过程与CDs@MIP合成一致。

1.2.2 荧光测定

向100mL PBS缓冲溶液(pH=9)中加入50mg CDs@MIP,剧烈搅拌以制备原液。依次向5mL离心管中加入2mL原液和一定体积不同浓度的SMZ标准溶液，得到SMZ终浓度为0、0.65、1.5、2.7、4、5、6.5、7.5、11、17.5和20μg/mL的混合液。将传感器溶液和SMZ均匀混合，然后在室温(25℃)下反应30min, 激发波长为365nm处测试荧光发射光谱。

为了验证CDs@MIP对SMZ的选择性，我们用同样的方法检测了其他SAs及常见干扰物对传感器的荧光响应。同时，在先加入上述结构类似物质的基础上，再次加入SMZ,观察荧光强度的变化以探究传感器对上述干扰物的抗干扰能力。

1.2.3 加标回收测试与实际样品分析

选取小鼠血清、大鼠血清和兔血清3种空白生物基质进行加标回收测试。首先取4mL解融后的血清，加入4mL甲醇沉淀蛋白，离心取上清液，并用PBS缓冲液稀释至20mL备用。每种血清样本分4份，其中1份作为空白对照，另外3份分别加入不同量的SMZ标准样品，制成最终浓度分别为1、5、15μg/mL的SMZ加标样品，并直接用1.2.2所示方法测试。为验证结果准确性，我们参照GB 29694-2013法，利用HPLC对测试结果进行验证。HPLC条件参数如下：色谱柱为ODS-3C18(250mm×4.5mm, 粒径5μm),流动相为0.1%甲酸水溶液和乙腈(V/V,50/50),流速为1.0mL/min, 柱温为30℃,进样体积为20μL,UV检测波长为270nm。

为进一步验证方法的实用性，我们选用尿液为实际样品进行分析。受试者首先口服复方磺胺甲恶唑两片(0.4g/片),在3、6、9h采集尿液样品，随即离心取上清液4mL,用PBS缓冲液稀释至10mL,并直接用1.2.2所示方法测试。测试结果的准确性参照上述色谱条件进行验证。

2、结果

2.1 CDs@MIP的表征

合成得到的CDs具有十分优异的荧光性能，在365nm波长的激发下，在444nm处有非常强的荧光发射峰(图2A),相对于罗丹明6G,其荧光量子产率达到了18%。CDs溶液在334nm处有一个紫外吸收峰，可归因于C=O和其他表面部分的n-p*跃迁[5]。将CDs作为信号源，与模板SMZ共聚得到印迹聚合物，在洗脱5次后就能将模板SMZ完全清洗干净(图2B),得到具有识别能力的荧光传感器CDs@MIP。如图2A所示，相比于CDs, 传感器CDs@MIP的最大发射波长略有蓝移，发射峰位置为440nm, 发射强度有小幅度下降，量子产率为12%。

通过FT-IR检测对CDs、CDs@MIP-SMZ、CDs@MIP、CDs@NIP的结构进行分析。如图2C所示，CDs在3438cm-1处有较宽的O-H伸缩振动，1620cm-1处出现C=O拉伸峰，证明羟基和羧基存在于CDs边缘和表面[7]。CDs@MIP-SMZ、CDs@MIP和CDs@NIP在459和780cm-1处有显著吸收，归属于Si-O伸缩振动峰，在1030cm-1和1122cm-1附近的强而宽的峰归因于Si-O-C和Si-O-Si不对称伸缩振动峰，这表明TEOS被成功地掺入，并表现出了很强的交联能力[8]。此外，在1554cm-1和3420cm-1处的FT-IR峰为N-H伸缩振动，在2937cm-1处的峰为C-H伸缩振动，表明CDs@MIP中存在APTES[5]。1636cm-1处的峰是由于HN-CO键合振动发生。与相同波段的CDs相比，CDs@MIP红外光谱中1380cm-1、1554cm-1处吸收峰的强度降低。以上结果表明，成功合成了分子印迹聚合物，并包被在CDs表面上形成了CDs@MIP和CDs@NIP。CDs@MIP和CDs@NIP的FT-IR光谱比较相似，表明它们具有相似的化学组成和表面基团。

通过TEM和SEM检测对CDs、CDs@MIP及CDs@NIP的表面形态和尺寸大小进行观察和分析。TEM显示CDs呈点状分布(图2D),其粒径分布较窄，为2.6～4.9nm。如图2E、2F所示，CDs@NIP与CDs@MIP微观形态相似，呈球形，这是溶胶-凝胶法制备MIP过程中小颗粒聚集导致的[8]。CDs@MIP表面较粗糙，形成较厚的印迹层，CDs@NIP因不具有特异识别空腔的印迹层，平均尺寸相对较小，表面较光滑。

通过X射线衍射仪(XRD)检测对CDs@MIP的晶体结构进行分析(图2G),CDs@MIP与CDs@NIP均在2θ=15°～35°处显示较宽的衍射峰，这可归因于非晶形二氧化硅相(JCPDS No.29-0085),表明纳米复合材料中存在二氧化硅聚合物层，且两者在晶体结构上相似，其显示已经将CDs@MIP中的模板分子洗脱干净。

通过X射线光电子能谱(XPS)检测对CDs@MIP的化学成分、元素种类、含量和氧化态进行分析(图2H),CDs@MIP的XPS谱图在532、399、284、153处呈现5个典型的峰，分别与O1s、N1s、C1s、Si2s和Si2p相关。C、N、O和Si的重量百分比分别为35.27%、7.7%、36.37%和20.67%。其中，Si2p的XPS光谱(图2I)在102.2eV处的峰对应Si-N键，102.7eV处的峰属于Si-O和Si-C键，表明SiO2有很强的交联能力，且成功与CDs交联。

图2 CDs@MIP的表征

2.2 测试条件优化

2.2.1 CDs@MIP的最佳检测浓度

CDs@MIP浓度对荧光检测SMZ的灵敏度有一定影响。过量的CDs@MIP会降低检测SMZ的灵敏度，少量的CDs@MIP会导致检测的线性范围狭窄。本实验探究了5μg/mL SMZ对浓度范围200～600μg/mL内CDs@MIP的荧光淬灭率(F0-F)/F0的影响。如图3A所示，当浓度为500μg/mL时，SMZ对CDs@MIP的荧光淬灭率最高。由于传感器的灵敏度与信噪比成正比，当CDs@MIP浓度低于500μg/mL时，传感器较低的荧光强度和信噪比会降低检测的灵敏度。当CDs@MIP浓度高于500μg/mL时，荧光自吸收现象也会降低检测的灵敏度[9]。因此，选择浓度为500μg/mL的CDs@MIP进行后续实验。

2.2.2 pH值的优化

pH对传感器的灵敏度有显著影响，过高过低的pH值都会影响传感器的稳定性以及与SMZ的结合效率。如图3B所示，探究CDs@MIP在不同pH值溶液中荧光淬灭率的变化。其中，F0和F分别代表不存在和存在浓度为5μg/mL SMZ时CDs@MIP的荧光强度。在较低的pH下，传感器对SMZ的淬灭效率较低，这主要是由于溶液中过多的氢离子会影响传感器与SMZ之间的氢键结合，导致SMZ的氨基质子化，难以被有效识别。此外，硅壳可在高碱性条件下电离使表面缺陷，导致结合位点结构破坏[10],这会影响CDs@MIP对模板分子的特异识别能力。在pH=9时荧光淬灭效果最好，且传感器的稳定性也符合检测要求，因此，选择pH=9的PBS缓冲溶液进行荧光测试。

2.2.3 CDs@MIP的稳定性和响应时间

探究CDs@MIP在pH=9的缓冲溶液中的稳定性(图3C)。每间隔5min对CDs@MIP的荧光强度进行测试，其在连续60min内具有相对稳定性，故CDs@MIP稳定性良好。继续探究CDs@MIP与SMZ的作用时间。测试了500μg/mL的CDs@MIP在120min内对浓度为5μg/mL SMZ的荧光响应变化。如图3D所示，荧光信号在0-30min内淬灭，此后下降速度趋缓，在60min后逐渐达到平衡，表明传感器与SMZ响应达到了平衡。故最终选择30min为CDs@MIP检测SMZ的最佳响应时间。

图3 CDs@MIP的测试条件优化

2.3 CDs@MIP对SMZ的定量识别检测

在确定最优检测条件后，将CDs@MIP和CDs@NIP分别对不同浓度的SMZ进行定量识别检测。如图4A所示，随着SMZ浓度的增加，CDs@MIP荧光强度呈大幅下降趋势，在浓度0～20μg/mL内呈现出良好的线性关系(图4B)。但在加入相同浓度SMZ后，CDs@NIP荧光强度下降程度显著小于CDs@MIP(图4C),这是由于CDs@MIP具有与SMZ在空间形状及官能团上相匹配的大量特异识别位点。

所制备的CDs@MIP的荧光猝灭机制可能是由于CDs@MIP向SMZ的能量转移或电荷转移。SMZ的吸收光谱接近CDs@MIP的间隙带(图4D),SMZ的吸收光谱与CDs@MIP的发射光谱之间没有光谱重叠(图2A),由于猝灭剂的吸收光谱和荧光团的发射光谱在通过能量转移进行荧光猝灭时必须重叠，故电荷转移可能是CDs@MIP荧光淬灭的主要原因。通常，当光以最佳激发波长照射时，电子从价带转移到导带，在价层中产生一个空穴，电子-空穴对的结合引起荧光发射。但SMZ与CDs@MIP的结合引起了CDs上电子-空穴对辐射复合的干扰。这样，来自SMZ的电子进入空穴并阻止受激电子的返回，从而导致荧光猝灭[9]。

图4 CDs@MIP的检测效果

进一步评估CDs@MIP和CDs@NIP识别SMZ检测的灵敏性。模板分子SMZ与CDs@MIP之间的淬灭关系可以用Stern-Volmer方程来表示：

F0/F=1+KSV[C]

其中，F0和F分别代表不存在和存在SMZ时CDs@MIP或CDs@NIP的荧光强度，[C]代表淬灭剂SMZ的浓度，Ksv代表Stern-Volmer方程的淬灭常数。如图4C所示，为CDs@MIP和CDs@NIP的线性方程。印迹因子IF(IF=KSV,MIP/KSV,NIP)高达15.3,印证了CDs@MIP对SMZ的超灵敏检测，再次证明CDs@MIP探针中产生了大量的识别位点，对SMZ的选择性显著优于CDs@NIP。

本方法的检出限(LOD,LOD=3δ/k,δ为空白测量值的标准偏差，k为拟合曲线的斜率，n=6)低至0.042μg/mL。通过与之前报道的其他检测SMZ方法相比(表1),本方法的灵敏性要显著优于同类型的方法，甚至是优于一些权威的色谱类方法。本方法的超灵敏的检测性能主要是源于传感器内部大量的特异性识别位点。

表1 检测SMZ不同方法的最低检出限比较

2.4 CDs@MIP的选择性及可再生性

用同样的方法验证传感器的选择性，在最佳测试条件下检测了传感器对SMZ(11μg/mL)和12种结构类似的SAs及常见干扰物(50μg/mL)的荧光响应。如图5A所示，传感器对SMZ的选择性显著优于其他结构类似的SAs, 表现出优异的选择性。这主要是由于在合成洗脱CDs@MIP的过程中，产生了大量的与SMZ结构、大小和形状相似特异性识别位点。当首先加入其他的干扰物，再次加入SMZ时，发现荧光会重新显著淬灭，表明荧光传感器也具备很强的抗干扰能力。

基于优异选择性的基础上，对传感器的循环利用性进行探究，在相同的测试条件下，通过洗脱-结合-洗脱-再结合多次循环进行重复荧光测试。先在pH值为9的溶液中检测空白传感器的荧光强度F0,再检测加入11μg/mL SMZ后溶液的荧光强度F,用甲醇溶液反复超声洗脱离心去除SMZ,再次得到CDs@MIP。如图5B所示，在进行6次循环利用后，CDs@MIP的荧光淬灭率仅略微上升，表明传感器对于SMZ依然有较好的识别能力和选择性，具备良好的可再生性，是一种具有较高实用价值的传感器。此外，随重复次数的增加，CDs@MIP的荧光强度有所下降，与循环反复操作中CDs@MIP内部无法完全洗脱至孔隙阻塞、印迹位点损坏和洗脱过程中少量探针的损失有关。

图5 CDs@MIP的选择性与及重复使用性

2.5 加标回收测试与实际样品分析

选取小鼠血清、大鼠血清和兔血清3种空白生物基质进行加标回收测试。加标量分别为1、5、15μg/mL,结果如表2所示。在3种血清样本中，本方法测得的回收率在87.0%～94.4%,均与HPLC法十分接近，有力证明本方法在血液样本中的可行性。

口服SMZ后会有20%～40%以原形经尿液排出，尿药浓度往往较高。因此，收集口服SMZ后不同时间段的尿样进行分析，用以验证该方法的准确性。如表3所示，口服3、6、9h后用本方法检测出的SMZ尿药浓度分别为3.24、6.56、4.12μg/mL,与HPLC检测结果3.79、7.18、4.67μg/mL比较接近，证明本方法具有较好的准确性。

表2 空白血液样本品加标回收测试结果

表3 实际尿液样品分析结果

3、讨论

本研究设计了一种简单、可靠、便捷的基于碳点印迹聚合物的CDs@MIP荧光传感器，用于痕量SMZ的超灵敏检测，与大多数常规分析技术相比，此方法具有优越的灵敏性、选择性、稳定性及可再生性等优点。

在传统的荧光检测基础上，本文研究将分子印迹技术与荧光分析法有机结合，通过溶胶-凝胶聚合反应形成高选择性的荧光传感器CDs@MIP,在实现灵敏、快速检测SMZ的同时，还提高了传感器的选择性和抗干扰能力，且具有良好的可再生性。本研究结果表明：传感器的线性范围为0～20μg/mL,检出限低至0.042μg/mL。在较低的LOD和较宽的线性范围内，利用SMZ能有效地淬灭CDs@MIP的荧光，且可通过肉眼便捷地检测到SMZ浓度的变化。最后，将CDs@MIP应用于对尿液和血液实际样品中SMZ的痕量检测，所测得的回收率接近传统的HPLC检测方法，进一步证明本方法具有较好的准确性。

总体而言，本研究方法能综合利用MIT的选择性和荧光检测的灵敏性优势，实现对尿液和血液中残留SMZ的超灵敏检测，对生物医学和环境保护具有一定的借鉴参考意义。但该研究方法也有一定局限性，CDs@MIP虽然已经在实际样品中得到初步验证，能实现对SMZ的快速分析检测，但由于还未真正进入临床研究，该方法在实际样品检测中的可行性、便捷性和准确性还有待继续探究。

参考文献:

[2]董华燕,杨黎明,祝靖.基于量子点的荧光特性检测磺胺二甲嘧啶[J].农产品加工,2017,(15):40

[6]张育珍,张博,余双,等.碳量子点及新型半胱氨酸分子印迹传感器的制备[J].化学工程师,2022,36(10):80

基金资助:湖北省自然科学基金青年项目(2022CFB877); 湖北省教育厅科研计划项目(Q20222807); 湖北科技学院博士启动项目(BK202215);湖北科技学院科研创新团队项目(2022T03);

文章来源:支悦,袁莹莹,陈妃,等.基于碳点印迹聚合物的荧光传感器对磺胺甲恶唑的超灵敏检测[J].湖北科技学院学报(医学版),2024,38(04):306-312.