金黄色葡萄球菌是一种在空气、灰尘、水及人与动物的排泄物中普遍存在的细菌[1]。其产生的毒力因子可引起人的多器官感染，如创口感染、泌尿系统感染、肺炎、菌血症、心内膜炎等，严重的可危及患者生命，是引起医院内感染的重要病原体之一[2];此外还可引起中毒性休克综合征和食物中毒，如其主要毒力因子的肠毒素(SEs)可引起呕吐、腹泻等症状[3]。抗菌药物的广泛使用使金黄色葡萄球菌的耐药性逐渐增加，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的出现，为临床治疗致病菌感染带来了重大的挑战。MRSA自1961年出现以来，一直是导致医院内交叉感染的重要病原菌[4],且其感染率呈现逐年上升的趋势[5]。本研究回顾性分析2022年马鞍山市临床检验中心分离的金黄色葡萄球菌的临床分布、耐药性、毒力基因特征，为制订针对性的管理措施提供科学依据，为控制金黄色葡萄球菌感染传播、提高抗菌药物使用效率和优化患者治疗结果提供依据。

1、材料与方法

1.1 标本采集

收集2022年马鞍山市临床检验中心内科、外科、急诊科和感染病科等多个临床科室分离的98株金黄色葡萄球菌。本研究通过马鞍山市临床检验中心审批[马人医学伦审(2024)第09-04号]。

1.2 仪器与试剂

VITEK MS全自动快速微生物质谱检测仪，以及VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定药敏分析仪和细菌鉴定卡(GP)、药敏卡(GP67)均为法国生物梅里埃公司产品；聚合酶链反应(PCR)仪为美国伯乐公司产品，试剂购自上海生工生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 病原菌分离鉴定

根据《全国临床检验操作规程》第4版，采用VITEK MS全自动快速微生物质谱检测仪和 VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定药敏分析仪对临床标本进行病原菌分离鉴定及耐药性分析。

1.3.2 药敏试验方法

采用VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定药敏分析仪及配套的药敏卡(GP67)进行药敏试验。结果参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2022年标准进行判读[6]。质控菌株为金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)。

1.3.3 肠毒素基因引物设计与合成

基于GenBank(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov)公开的金黄色葡萄球菌肠毒素基因序列，使用Primer Premier软件设计，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

表1金黄色葡萄球菌肠毒素基因引物及序列

1.3.4 肠毒素基因PCR检测

采用煮沸法从菌落中提取DNA,挑取平板上的2～3个菌落放入400 μL三蒸水中，混匀，100 ℃煮沸15～30 min后，以12 000 r/min离心10 min, 取出上清液，并保存在—20 ℃冰箱中备用。吸2 μL上清液标本作为PCR扩增模板。PCR扩增反应体系体积为20 μL,其中2×Taq PCR Master Mix 10 μL,10 μmol/L的正、反向引物各1 μL,灭菌 ddH2O 6 μL,DNA模板2 μL。离心混匀完成后，置PCR仪上进行扩增反应。反应条件：94 ℃预变性5 min, 94 ℃ 30 s, 50～55 ℃ 30 s, 72 ℃30 s至1 min, 以上反应经30次循环后，72 ℃延伸10 min。以DNA标志物为分子量标准，取5 μL的扩增产物与1 μL上样缓冲液(6×Loading buffer)混匀后，点样于含核酸染料的2%琼脂糖凝胶，150 V电泳20 min 后，在凝胶成像仪中观察结果并照相。

1.3.5 全基因组测序与分析

选取标本中多药耐药的金黄色葡萄球菌，采用柱式DNA提取套件按照制造商说明书进行细菌全基因组DNA的提取。使用Nextera XT DNA Library Preparation Kit构建文库，经Illumina平台进行高通量测序，以获得足够覆盖度的测序数据。使用SPAdes软件[7]进行基因组组装，再利用Prodigal[8]进行基因注释。应用CARD数据库(https: //card.mcmaster.ca/)识别耐药基因，进一步了解菌株的耐药性。

1.4 统计学处理

采用WHONET 5.6统计软件对耐药性基因的分布进行统计分析。

2、结果

2.1 标本检出率与分布

98株金黄色葡萄球菌中，包含29株MRSA,占总分离株数的29.59%。98株金黄色葡萄球菌主要来源于分泌物标本(40株，40.82%),其次是痰液(36株，36.73%)、脓液(6株，6.12%)和血液(6株，6.12%)。其他标本类型如引流液、尿液、穿刺液和羊水的检出率较低。

2.2 药敏试验结果

分离的金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药率最高(97株，98.97%),其次是红霉素(53.06%)和克林霉素(46.94%),而对庆大霉素、复方磺胺甲噁唑、环丙沙星、左氧氟沙星和莫西沙星的耐药率相对较低，对喹努普汀/达福普汀、利福平、利奈唑胺、万古霉素表现出完全敏感。见表2。

2.3 MRSA菌株耐药特征

29株MRSA对青霉素和苯唑西林表现出完全耐药，而对其他抗菌药物的耐药性各不相同。对于喹努普汀/达福普汀、利奈唑胺、万古霉素和利福平均表现出100.00%的敏感性。见表3。头孢西丁筛选、诱导克林霉素以最小抑菌浓度(MIC)值阳性与阴性表示，MRSA菌株头孢西丁筛选全为阳性；诱导克林霉素11株阳性、18株阴性。

表2金黄色葡萄球菌药敏试验结果[n(%)]

2.4 金黄色葡萄球菌肠毒素基因检出与分布

PCR检测结果显示，98株金黄色葡萄球菌均携带至少1种肠毒素基因，见表4。SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEF基因检出率分别为95.92%、9.18%、71.43%、7.14%、5.10%、31.63%,其中SEA基因检出率最高，其次是SEC基因和SEF基因，SEB、SED和SEE基因的检出率较低。

表3 MRSA菌株耐药情况[n(%)]

2.5 多药耐药金黄色葡萄球菌的耐药基因情况

共选取13株多药耐药金黄色葡萄球菌基因组进行了耐药基因预测，共发现了26个耐药基因，这些基因可以分为11个大类。所有菌株均含有氟喹诺酮类抗菌药物耐药基因(包括arlR、arlS、norA、norC、Saur_norA和sdrM)、氨基嘧啶类抗菌药物耐药基因(如dfrC)、消毒剂类和防腐剂(sepA)类耐药基因、多药耐药基因(mgrA)及四环素类抗菌药物耐药基因[如mepA、mepR和tet(38)]。另外，还发现了不同菌株之间存在着耐药基因的差异。例如，不同菌株中检测到了氨基糖苷类抗菌药物耐药基因[如AAC(6′)-le-APH(2″)-la、ANT(4′)-lb、ANT(9)-la]、夫西地烷类抗菌药物耐药基因(如fusB)、林可霉素类抗菌药物耐药基因(如lnuA)、大环内酯类抗菌药物耐药基因(如ermA、ermB、ermC)、培南类抗菌药物耐药基因(如mecA、mecR1、PC1_blaZ)、磷霉素类抗菌药物耐药基因(如fosB)。此外，四环素类抗菌药物耐药基因中还发现了其他类型，如tetK、tetM。见图1。

表4 98株金黄色葡萄球菌肠毒素基因的分布(n)

图1 13株多药耐药金黄色葡萄球菌耐药差异分布热图

3、讨论

本研究收集的金黄色葡萄球菌主要标本来源为分泌物和痰液，说明金黄色葡萄球菌在呼吸道感染及一些炎症中较为常见。作为医院和社区获得性感染的常见致病菌，金黄色葡萄球菌分布广泛、致病性强，且存在多种耐药菌株，使得临床治疗金黄色葡萄球菌成为公共卫生领域中的重大挑战[9]。特别是MRSA的出现和多重耐药性的增加，给临床治疗带来了巨大困难[10]。

药敏试验结果显示，金黄色葡萄球菌对青霉素的高耐药率与滁州某医院[11]、湖南省[12]细菌耐药性监测结果相似，强调了抗菌药物广泛使用对耐药性增加的促进作用，而金黄色葡萄球菌和MRSA对喹努普汀/达福普汀、利福平、利奈唑胺和万古霉素的全面敏感性，则提示这些药物可作为治疗MRSA等耐药菌株感染的优先选择，同时也需警惕这些抗菌药物的使用可能会促进耐药性变迁。因此，在临床应用中，必须严格控制这些药物的使用，以延缓耐药性的进一步发展。

与CHINET的2022年数据相比，马鞍山市临床检验中心MRSA的检出率略低，也明显低于尹莎莎等[13]报道的37.34%,以及谢强等[11]报道的44.1%,与湖南省2021年MRSA检出率接近[12],反映了马鞍山市临床检验中心细菌耐药监测和多重耐药菌控制措施相对有效。MRSA对β-内酰胺类抗菌药物的高耐药率主要是因为mecA基因编码的PBP2a蛋白代替原来的青霉素结合蛋白PBP2,造成β-内酰胺类抗菌药物结合位点的缺失而导致对该药物的耐药[14]。

本研究结果显示，MRSA对临床其他常用抗菌药物的耐药性存在差异，这提示临床医生在选择抗菌药物时必须更加谨慎，并应重视细菌培养，以便选择最有效的治疗方案。与其他研究结果进行比较发现，其他研究中也报告了MRSA对多种抗菌药物耐药性的明显差异，这进一步强调了根据具体耐药谱调整治疗策略的重要性[15-16]。例如，ZHANG等[17]的研究结果显示，MRSA对临床使用的抗MRSA药物，包括万古霉素、达托霉素、利奈唑胺等都有不同程度的耐药。FOSTER[18]也指出，不同MRSA菌株对抗菌药物的耐药性差异明显，强调了个体化治疗的必要性。

金黄色葡萄球菌携带的肠毒素基因种类繁多，分布广泛[19]。不同类型的肠毒素基因在金黄色葡萄球菌中的分布越来越受到关注。陈培超等[2]在上海某医院环境中(病区扶手、患者的枕头被褥和床头等)检出的54株金黄色葡萄球菌及患者分离的75株金黄色葡萄球菌中肠毒素基因的携带率分别为48.15%和61.33%,以SEB、SEA、SEC等3种毒力基因携带为主。另外，汪永禄等[20]对马鞍山市临床患者标本中55株金黄色葡萄球菌SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SHE、SEI、SEJ等9种肠毒素基因检测，结果表明其以携带SEA、SEB和SEC这3种肠毒素基因为主。本研究中金黄色葡萄球菌肠毒素基因的检测结果显示，SEA、SEC和SEF基因在马鞍山市临床检验中心分离的菌株中广泛存在，与其他研究结果基本一致[2,20]。本研究对收集的医源性金黄色葡萄球菌肠毒素进行检测，98株金黄色葡萄球菌均携带5种不同的肠毒素基因，其中SEA基因检出率最高，为95.92%,其次是SEC(71.43%)和SEF(31.63%)。在金黄色葡萄球菌肠毒素中，较为常见的是SEA型，而SEF型肠毒素有可能导致人体出现中毒性休克[21]。这些肠毒素基因的高携带率不仅增加了金黄色葡萄球菌致病性，也可能对临床治疗和医院内感染防控造成巨大挑战。

13株多药耐药金黄色葡萄球菌的基因组测序结果显示它们普遍具有对氟喹诺酮、二氨基嘧啶类、四环素类抗菌药物的抗性。这与其他研究中金黄色葡萄球菌药敏试验结果基本一致[18,22],进一步验证了这些耐药性的存在。这提示在临床实践中，医生在选择抗菌药物治疗时需要谨慎考虑金黄色葡萄球菌可能存在的多重耐药性，以避免治疗失败和耐药菌株的进一步传播。另外，耐药基因在不同菌株中的分布差异表明金黄色葡萄球菌具有较高的遗传多样性。这种多样性可能是由于不同菌株在不同环境条件下的适应性演化而产生的。了解菌株间耐药基因的多样性，有助于揭示金黄色葡萄球菌的进化机制和流行病学特征，从而为预防和控制金黄色葡萄球菌感染提供更有效的策略[23]。

本研究结果表明，对金黄色葡萄球菌临床分离株进行细致的耐药性和肠毒素基因监测具有重要意义，不仅有助于指导临床合理用药，还对预防和控制医院内感染至关重要。未来的研究应进一步探索金黄色葡萄球菌耐药性和毒力因子的动态变化，以及针对这些因素应采取什么样的有效感染治疗策略和预防措施。基于本研究的发现，可以进一步制订和优化抗菌药物的使用指南，减少不必要的β-内酰胺类抗菌药物使用，从而降低耐药菌株的选择压力。其次，未来可以通过基因检测手段，快速识别mecA基因阳性的MRSA菌株，从而在早期干预中采取更有效的治疗措施。

综上所述，马鞍山市临床检验中心分离的98株金黄色葡萄球菌表现出明显的耐药性，以SEA、SEC和SEF肠毒素基因为主。全基因组测序分析进一步揭示了其耐药和致病力背后的复杂机制，为制订有效的预防和治疗策略提供了依据。未来的工作应继续关注MRSA耐药性的变化趋势，并开发更精准的诊断和治疗方法，以有效控制和预防医院内感染的发生。

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基金资助:国家科技基础资源调查专项(2021FY100900);

文章来源:王芳,刘晓,任小东,等.马鞍山市临床来源金黄色葡萄球菌的耐药性和肠毒素基因特征分析[J].检验医学与临床,2024,21(24):3631-3636.