创新药物上市后，随着临床数据和用药经验的积累，对药物的生物药剂学特性、安全性和有效性的认识深入。药物的原料、制剂和给药方案可能会发生变化，这些变更可能影响药代动力学行为。因此，必要时需进行生物利用度(bioavailability, BA)和生物等效性(bioequivalence, BE)研究，以确保药物的安全性和有效性[1-3]。本研究通过超高效液相色谱-串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS)法对我国某制药生产的仿制药普瑞巴林即受试制剂(test, T)与原研药即参比制剂(reference, R)进行BE研究，以推动我国仿制药质量发展，拓展临床应用可选择性。

一、材料与方法

1 材料

药品与试剂受试制剂(T):普瑞巴林胶囊，规格：每粒150 mg, 批号：20181203,海南万玮制药有限公司生产；参比制剂(R):普瑞巴林胶囊，规格：每粒150 mg, 批号：W69517,批准文号：国药准字H20150622,德国Pfizer Manufacturing Deutschland GmbH生产。普瑞巴林对照品，含量：98%,批号：1787-022A1,购自加拿大TLC PHARMACEUTICAL STANDARDS公司；普瑞巴林-d4(内标),纯度：99.1%,批号：2904-018A1,购自加拿大TLC PHARMACEUTICAL STANDARDS公司。

仪器1290 Infinity Ⅱ液相色谱仪，美国Agilent Technologies公司产品；API 4000质谱仪，美国Applied Biosystems/Sciex公司产品。

2 受试者选择

本研究获得厦门大学附属第一医院医学伦理委员会药物临床试验分会批准，伦理批号：[2019]药伦审字(017)号，临床试验平台登记号：CTR20191593,所有受试者均签署知情同意书。空腹试验入选24例受试者，体质量为(62.00±6.62)kg, 平均体质量指数为(22.77±2.18) kg·m-2,年龄为(29.58±10.23)岁，男性受试者16例，有3例受试者为其他民族(苗族、彝族、土家族),其余均为汉族。餐后试验入选24例受试者，体质量为(58.13±6.88)kg, 平均体质量指数为(21.33±2.02)kg·m-2,年龄为(25.29±5.06)岁，男性受试者17例(70.8%),有6例受试者为其他民族(彝族、土家族、黎族、维吾尔族、布依族),其余均为汉族。

入选标准①年龄 18～65 周岁(含临界值);②体质量指数在18.0～27.0 kg·m-2,男性受试者体质量≥50.0 kg, 女性受试者体质量≥45.0 kg; ③入组前全身体检合格的健康者。

排除标准①体格检查、方案规定的实验室检查异常有临床意义者；②有特殊系统疾病者(包括不仅限于心、肝、肾、内分泌、消化道等);③过敏体质。

3 给药方案与血样采集

本方案采用单中心、随机、开放、两周期、两序列、双交叉、单次给药试验设计。在空腹或餐后状态下给予T或R,试验每周期给药1次，清洗期为5 d。

受试者将按要求至少于给药前(餐后试验为进食高脂餐前)10 h禁食、不禁水过夜；在每周期给药第1天，按照随机表，空腹或餐后服用T 1粒(150 mg)或R 1粒(150 mg),温水240 mL送服。

空腹试验分别在给药0 h(给药前 60 min 内)和 0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.50、3.00、4.00、6.00、8.00、12.00、24.00 h, 共 16 个时间点采集静脉血；餐后试验分别在给药 0 h(给药前 60 min 内)和 0.33、0.67、1.00、1.33、1.67、2.00、2.33、2.67、3.00、3.50、4.00、6.00、8.00、12.00、24.00 h, 共 16 个时间点采集静脉血；每次取血约 4 mL 至含肝素钠抗凝剂的采血管中，轻柔颠倒混匀数次，采集后的血样在2～8 ℃条件下离心 10 min(1 800 ×g)后分离血浆样品。血样采集后应在60 min内完成离心，120 min 内完成血样的预处理并放入-70 ℃左右冰箱存放待测。

4 测定方法与血浆样本处理

色谱条件安捷伦色谱柱(ZORBAX Eclipse Plus C18,2.1 mm×50.0 mm, 1.8 μm),流动相浓度：含0.05%甲酸的水溶液(A)-100%乙腈(B),用10%B进行等度洗脱1.8 min, 流速：0.3 mL·min-1,柱温：30 ℃。进样体积：10 μL。

质谱条件用电喷雾电离源，模式为正离子多反应监测。离子源主要参数设置如下：喷雾电压(ionspray voltage)为5 500 V,气帘气为172.37 kPa, 雾化气为379.21 kPa, 辅助加热气为413.68 kPa, 温度为550 ℃,接口加热器(ihe)为ON,入口电压为10 V,碰撞池出口电压为13 V,碰撞气为41.37 kPa。待测物主要参数：普瑞巴林m/z160.2→124.1,去簇电压60 V,碰撞电压21 V;普瑞巴林-d4m/z164.3→128.2,去簇电压60 V,碰撞电压19 V。

血浆样本处理取血浆样品50 μL,加入内标工作液50 μL,再加入乙腈400 μL,混合后在涡旋仪上震摇10 min。在4 ℃下，以4 000 r·min-1转速，离心5 min。取离心后的上清液50 μL加入2 mmol·L-1NH4FA水溶液450 μL,封板，震摇10 min, 充分混匀，处理后样本即可进行分析。

5 方法学考察与评价

专属性取空白人血浆、定量下限标准曲线样本进行分析得到相应的色谱图。普瑞巴林和内标普瑞巴林-d4的保留时间分别为1.13和1.11 min, 见图1。结果表明，该分析方法专属性强。

标准曲线与定量下限配制含普瑞巴林的人血浆样本，各质量浓度分别为40.00、80.00、160.00、800.00、2 000.00、4 000.00、8 000.00和1.00×104ng·mL-1,按“血浆样本处理”项下操作后进样分析。以待测物(普瑞巴林)浓度为横坐标(x),待测物与内标(普瑞巴林-d4)峰面积的比值为纵坐标(y),权重系数用1/x2对标准曲线进行回归运算，回归模型用y=ax+b。普瑞巴林在40.00～1.00×104ng·mL-1内，有良好的线性关系，因此，分析方法学的定量下限确定为40.00 ng·mL-1。共制备3个准确度与精密度分析批，其标准曲线回归方程和对应的回归系数分别为y=1.3×10-3x+6.6×10-3(R2=0.996 6),y=1.3×10-3x+4.6×10-3(R2=0.999 4),y=1.3×10-3x+3.1×10-3(R2=0.999 6)。

精密度与回收率按照分析方法学验证方案要求配制普瑞巴林定量下限、低、几何均值中浓度、中、高5个质量浓度的质控样本(40.00、120.00、1 200.00、5 000.00和7 500.00 ng·mL-1),每个质控分析6个重复，连续分析3次。经分析方法学的精密度和回收率分析，普瑞巴林和普瑞巴林于人血浆中的精密度和回收率，见表1。

图1人血浆中普瑞巴林(A)和内标普瑞巴林-d4(B)的典型色谱图

表1用超高效液相色谱-串联质谱法测定普瑞巴林在人血浆中的精密度和回收率

基质效应在高、中、低质量浓度(7 500.00、5 000.00和120.00 ng·mL-1)水平下，普瑞巴林的内标归一化的基质因子均值为99.50%～105.00%,精密度为 ≤ 2.0%,3个浓度水平内标归一化的基质因子总平均值为101.50%,精密度为3.02%。

稳定性配制含普瑞巴林的低、高质量浓度(120.00和7 500.00 ng·mL-1)的全血和血浆质控样本，分别考察全血质控样本室温放置2 h、血浆质控样本室温下立即处理、室温放置23 h、样本处理后自动进样器5 ℃条件下内放置189 h、-20 ℃/-70 ℃反复冻融4次、-20 ℃/-70 ℃长期存放37 d的稳定性。验证显示，普瑞巴林在全血和血浆中有良好的稳定性。

6 统计学处理

药代动力学参数计算及描述性统计、Cmax和AUC的分析用Phoenix WinNonlin (8.0)软件；tmax分析用非参数检验；受试者基本资料和安全性分析用SAS(9.4)软件。分别将空腹/餐后试验R和T的主要药代动力学参数Cmax、AUC0-t、AUC0-∞经过对数转换后，进行方差分析，方差分析模型中以给药序列、周期、制剂为固定效应，以个体(序列)为随机效应。计算T与R的主要药代动力学参数Cmax、AUC0-t、AUC0-∞几何均值比的90%置信区间。

二、结果

1 平均血药浓度-时间曲线

空腹试验入组24例受试者，其中23例受试者按照试验要求完成样品采集，1例受试者出现“上呼吸道感染”退出试验，仅完成第一周期试验。空腹受试者的血药浓度-时间曲线，见图2A。餐后试验入组24例受试者，24例受试者全部按照试验要求完成样品采集。餐后受试者的血药浓度-时间曲线，见图2B。

2 药代动力学参数

健康受试者空腹和餐后口服普瑞巴林胶囊的药代动力学参数，见表2。

3 生物等效性分析

空腹试验T和R的Cmax的几何均值比90%置信区间为94.79%～110.42%,AUC0-t的几何均值比90%置信区间为97.76%～102.87%,AUC0-∞的几何均值比90%置信区间为97.13%～102.87%。餐后试验T和R的Cmax的几何均值比90%置信区间为95.83%～102.98%,AUC0-t的几何均值比90%置信区间为97.62%～100.83%,AUC0-∞的几何均值比90%置信区间为97.33%～101.39%。空腹和餐后试验T和R的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞的几何均值比90%置信区间在BE要求的等效范围(80.00%～125.00%)内。同时，空腹和餐后试验T和R的tmax进行两配对样本的非参数检验Wilcoxon符号秩和检验，结果表明，T和R的tmax比较，在统计学上差异无统计学意义(P>0.05)。

图2健康受试者空腹(A)和餐后(B)口服普瑞巴林胶囊的平均血药浓度-时间曲线

表2健康受试者空腹和餐后口服普瑞巴林胶囊的药代动力学参数

4 安全性评价

24例受试者空腹口服T后发生5例数10例次不良事件，其中1例受试者发生“上呼吸道感染”的中度(Ⅱ级)不良事件，并因此退出试验，其余受试者发生的不良事件均为轻度(Ⅰ级)不良事件，判定为肯定有关有头晕3例、恶心2例。23例受试者空腹口服R后发生5例数8例次不良事件，均为轻度(Ⅰ级)不良事件，其中判定为肯定有关有头晕3例、恶心2例，判定为可能有关有窦性心动过缓1例，未进行处置和治疗，最迟的在末次给药后的73 h转归。

餐后口服T后发生1例数2例次不良事件，餐后口服R后发生5例数6例次不良事件，其中R和T各出现1例血尿酸升高和1例肌酸激酶升高，判断为可能有关，R还发生手掌出汗和头晕各1例，判断为很可能有关。上述药物不良反应均未进行处置和治疗。

三、讨论

国内外发表的研究中[4-12],普瑞巴林在血浆中的浓度较高，前处理方法较为简单，国内研究[4-11]主要用甲醇进行蛋白沉淀，RAMAKRISHNA等[12]的研究用甲基叔丁基醚和二氯甲烷(80∶20)的混合溶液进行萃取；液相分析时间在4～13 min。7篇文献[4-10]报道用电喷雾电离源，2篇文献[11-12]报道用大气压化学电离源(atmospheric pressure chemical ionization, APCI)源。本研究用乙腈进行蛋白沉淀，等度洗脱1.8 min, 用电喷雾电离源进行检测，分析方法操作简单，分析时间短，提高了分析效率。在方法摸索过程中，经调研及方法摸索，普瑞巴林极性较强，样品进样次数多了以后，色谱峰形会改变，在最终复溶液中添加2 mmol·L-1NH4FA可以使峰形稳定，解决方法的基质效应，使得方法稳定耐用。

本研究结果显示，普瑞巴林胶囊空腹试验Cmax比餐后试验高近1倍，tmax比餐后试验早约2.75 h, 但AUC与餐后试验差别不大。说明饮食对普瑞巴林的吸收速度有较大影响，但对吸收程度无影响。

空腹试验出现的药物不良反应例次是餐后的1倍，胃肠道药物不良反应恶心和呕吐，以及神经系统药物不良反应头晕尤为明显。对于有胃肠道疾病或胃肠功能不良的患者建议饭后服药以减轻胃肠道药物不良反应；有神经系统基础疾病尤其是眩晕相关的及老年的患者，建议进行相应的评估权衡利弊再作出是否用药的决定。

参考文献:

[1]国家药品监督管理局.关于发布《创新药人体生物利用度和生物等效性研究技术指导原则》的通告(2022年第4号)[eb/ol].2022-01-07[2024-02-05].

[2]国家药品监督管理局.总局关于发布人体生物等效性试验豁免指导原则的通告(2016年第87号)[eb/ol].2016-05-21[2024-04-24].

[4]黄洁,阳晓燕,项玉霞,等.普瑞巴林缓释片在中国健康男性受试者的人体相对生物利用度及生物等效性研究[j].中国临床药理学杂志,2016,32(24):2261—2265.

[5]刘艳艳,万昶宸,周春华,等.hplc-ms/ms法测定癫痫患者体内普瑞巴林的血药浓度[j].中国临床药理学杂志,2017,33(7):628—630.

[6]李银洛,唐才林,盛长城,等.高效液相色谱串联质谱法同时测定人血浆中加巴喷丁和普瑞巴林浓度[j].中国药业,2023,32(23):67—71.

[7]张吉刚,查怡鑫,金舒静,等.普瑞巴林胶囊在中国健康受试者空腹和餐后状态下的生物等效性研究[j].中国临床药理学杂志,2023,39(21):3159—3163.

[8]高茸,马亚中,赵海霞,等.普瑞巴林缓释片在中国健康受试者中的生物等效性研究[j].中国临床药理学杂志,2022,38(13):1516—1521.

[9]高梓真,周英珍,郭玉,等.普瑞巴林缓释胶囊的制备及体内外评价[j].中国医药工业杂志,2021,52(8):1049—1055.

[10]夏韵婕,王增明,高静,等.普瑞巴林缓释片体外释放度及比格犬体内药代动力学研究[j].国际药学研究杂志,2020,47(8):658—665.

[11]徐凤华,黄明,张全英.lc-ms/ms测定人血浆中普瑞巴林浓度及其药动学研究[j].中国药学杂志,2017,52(3):221—225.

文章来源:许浩云,伊金玲,林伊莉,等.普瑞巴林胶囊在中国健康受试者体内的生物等效性研究[j].中国临床药理学杂志,2024,40(24):3621-3625.