慢性酒精性肝损伤大鼠肝脏采用丹酚酸B对其的保护作用

2020-08-27 204 上传者：管理员

摘要：目的探讨丹酚酸B通过调控丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组成的异源三聚体依赖的蛋白激酶α1(AMPKα1)激活沉默信息调节因子2相关酶I(SIRT1)减轻酒精性肝损伤(ALD)的作用机制。方法用酒精液体饲料喂养建立ALD大鼠模型;另选大鼠普通饲料喂养作为空白组和对照组,将造模成功大鼠随机分为3组:模型组、低、高剂量实验组;每组均为8只。对照组、低、高剂量实验组灌胃给予丹酚酸B溶液30,15,30mg·kg-1;空白组和模型组灌胃给予等量的0.9%NaCl,连续给药8周。用试剂盒检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平。用蛋白免疫印迹法(WesternBlot)检测大鼠肝脏组织SIRT1、AMPKα1及p-AMPKα1的蛋白表达情况。结果空白组、对照组、模型组、低、高剂量实验组的血清ALT水平分别为(24.37±2.08),(23.09±1.02),(59.97±3.68),(43.39±2.91)和(39.08±2.17)U·L-1;SIRT1蛋白表达相对水平分别为0.60±0.02,0.75±0.03,0.13±0.02,0.20±0.01,0.27±0.01;p-AMPKα1蛋白表达相对水平分别为1.01±0.01,1.52±0.10,0.45±0.02,0.62±0.04,0.71±0.05。模型组与空白组比较,低、高剂量组与模型组比较,上述指标的差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论丹酚酸B通过调控AMPKα1磷酸化水平激活SIRT1蛋白表达,进而发挥其抗慢性酒精性肝病的保护作用。

关键词：
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组成的异源三聚体依赖的蛋白激酶α1
丹酚酸B
沉默信息调节因子2相关酶Ⅰ
药理特性
酒精性肝损伤
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丹酚酸B具有抗氧化、抗炎、抗纤维化等多种药理特性。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组成的异源三聚体依赖的蛋白激酶α1(AMPKα1)/沉默信息调节因子2相关酶Ⅰ(SIRT1)通路具有调控酒精引起的肝细胞脂质堆积和氧化应激反应的作用[1]。本实验构建慢性酒精性肝病(ALD)大鼠模型,探讨丹酚酸B与p-AMPKα1/SIRT1可能的分子作用机制。

材料与方法

1、材料

动物SD大鼠,体重180～200g,购自大连医科大学SPF实验动物中心。动物许可证号:SCXK(辽)2008-0002。

药品与试剂丹酚酸B(纯度≥99%),上海融合医药科技发展有限公司生产。丙氨酸氨基转移酶(ALT)试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒、总胆固醇(TC)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒、乙醇脱氢酶(ADH)试剂盒,南京建成生物工程研究所生产。

仪器CT15RE离心机,日本HITACHI公司产品;165-8001电泳仪,美国伯乐公司产品。

2、实验方法

2.1ALD大鼠模型建立[2]2]

大鼠用Liber-DeCarli酒精液体饲料喂养,酒精浓度前6周5%,后2周8%。

2.2分组和给药[3]3]

按照随机数字表法选取16只大鼠为空白组和对照组,每组8只,并给予普通饲料喂养。将造模成功大鼠分为3组:模型组、低、高剂量实验组,每组8只。

对照组、低、高剂量实验组灌胃给予30,15,30mg·kg-1丹酚酸B溶液;空白组和模型组灌胃给予等量的0.9%NaCl。各组均每日给药1次,连续给药8周。

2.3检测指标

2.3.1用试剂盒检测ALT、AST的活性和TC、TG的水平

大鼠麻醉后,腹主动脉取血,血液静置30min后,3000r·min-1离心10min,取上层血清至1.5mLEP管,按照参考文献[3]方法检测各组大鼠血清中ALT、AST的活性和TC、TG的含量。

2.3.2用试剂盒检测大鼠肝脏ADH活性

按照参考文献[3]方法测定各组大鼠肝脏中ADH活性。

2.3.3用蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测SIRT1、AMPKα1及p-AMPKα1蛋白表达水平

取大鼠肝脏组织50mg,加入裂解液,低温剪碎,匀浆机将组织破碎,静置5min,以1.3×104r·min-1离心10min,吸取上清液备用。按照参考文献[3,4]方法检测大鼠肝脏组织SIRT1、AMPKα1及p-AMPKα1蛋白表达情况。

3、统计学处理

用SPSS19.0软件进行统计分析。计量资料用x¯±s表示,两组间均数比较用t检验,各组间均数比较用单因素方差分析,检验方法为SNK法。

结果

1、各组大鼠血清ALT、AST、TG、TC比较

模型组与空白组比较,血清ALT、AST、TG、TC均显著升高,差异均有统计学意义(均P<0.01);低、高剂量实验组与模型组比较,上述指标均呈剂量依赖性下降,差异均有统计学意义(均P<0.01)。见表1。

2、丹酚酸B对大鼠血清乙醇代谢的影响

ADH是肝脏中酒精代谢的主要酶。空白组、对照组、模型组、低、高剂量实验组的ADH分别为(248.39±12.66),(233.67±10.25),(169.15±11.45),(189.33±6.99),(198.74±5.24)U·mg-1,模型组与空白组比较、低、高剂量实验组与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.05)。

表1各组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)比较

3、丹酚酸B对SIRT1表达和AMPKα1磷酸化水平的影响

空白组、对照组、模型组、低、高剂量实验组的SIRT1蛋白表达相对水平分别为0.60±0.02,0.75±0.03,0.13±0.02,0.20±0.01,0.27±0.01,对照组及模型组与空白组比较,低、高剂量组与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。

空白组、对照组、模型组、低、高剂量实验组的p-AMPKα1/AMPKα1蛋白表达相对水平分别为1.01±0.01,1.52±0.10,0.45±0.02,0.62±0.04,0.71±0.05,对照组、模型组与空白组比较,低、高剂量组与模型组比较,差异均有统计学意义(均P<0.01)。

讨论

本研究结果显示,丹酚酸B低、高剂量实验组血清ALT、AST、TG、TC水平均显著低于模型组,肝脏组织ADH水平明显高于模型组,且均呈剂量依赖性。说明丹酚酸B对ALD有显著的保护作用,并可恢复ADH活性,促进酒精代谢。本实验结果表明,模型组p-AMPKα1及SIRT1的蛋白表达显著低于空白组。实验组可显著上调AMPKα1的磷酸化水平,介导SIRT1活化,发挥抗ALD的作用,为临床防治ALD提供了新的理论依据。

邱璐璐,蔡钊萌,张宁.丹酚酸B对慢性酒精性肝损伤大鼠肝脏的保护作用[J].中国临床药理学杂志,2020,36(16):2419-2421.

基金:辽宁省自然科学基金资助项目(20170540257)