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溃疡性结肠炎大鼠采用丹参酮ⅡA治疗的效果分析

2020-08-27 260 上传者：管理员

摘要：目的研究丹参酮ⅡA对2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的溃疡性结肠炎大鼠的治疗作用及机制。方法用TNBS法构建溃疡性结肠炎大鼠模型,将建模成功的大鼠随机分为模型组和低、高剂量实验组,每组15只,正常组大鼠不进行干预。建模后48h,实验组灌胃100,200mg·kg-1·d-1丹参酮ⅡA,正常组与模型组则灌胃等量生理盐水,每天1次,连续干预7d。以酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清相关因子含量;用免疫组化法检测结肠组织白细胞介素-1β(IL-1β)表达情况,以蛋白质印迹(WB)法及实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法检测结肠组织磷酸化-p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)、NADPH氧化酶(NOXs)表达。结果干预结束后,正常组、模型组和低、高剂量实验组血清IL-1β分别为(32.15±2.04),(125.46±5.02),(79.52±4.12),(46.25±3.85)pg·mL-1,IL-6分别为(355.23±51.14),(469.15±48.25),(419.58±45.16),(385.45±24.16)pg·mL-1,活性氧簇(ROS)分别为(1456.25±135.24),(4569.23±152.36),(3649.52±124.59),(2456.31±159.67)pg·mL-1,NOXs分别为(459.35±26.48),(698.47±34.26),(569.47±42.16),(501.23±26.78)pg·mL-1,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论丹参酮ⅡA可有效抑制溃疡性结肠炎大鼠炎性反应,其作用机制可能与有效下调结肠组织p-p38MAPK、NOXs表达相关。

关键词：
p38丝裂原活化蛋白激酶
丹参酮ⅡA
活性氧簇
溃疡性结肠炎
炎性因子
肠道炎症
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溃疡性结肠炎是临床慢性肠道炎症性疾病,病变常累及黏膜及黏膜下层[1]。氧化应激致机体免疫功能紊乱参与溃疡性结肠炎的发病。丹参酮ⅡA为中药丹参有效成分之一,具有抑制血小板聚集、清除氧自由基、改善能量代谢、抗炎等功能[2,3]。本研究旨在探讨丹参酮ⅡA对溃疡性结肠炎模型大鼠的治疗作用及其作用机制。

材料与方法

1、材料

动物SPF级SD大鼠,雄性,6～7周龄,体重(220±20)g,购自温州医科大学实验动物中心。动物生产许可证号:SCXK(浙)2015-0001。

药品与试剂丹参酮ⅡA磺酸钠注射液,规格:每支10mg/2mL,批号:161102,170805,批准文号:国药准字H31022558,上海第一生化药业有限公司生产。2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS),Solarbio公司生产;活性氧簇(ROS)、NADPH氧化酶(NOXs)酶联免疫吸附(ELISA)检测试剂盒,均为武汉博士德生物工程有限公司生产;兔抗鼠磷酸化-p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)、NOXs多克隆抗体,均为英国Abcam公司生产。

仪器CKX41倒置显微镜,日本奥林巴斯公司产品;Q550图像处理系统,德国LEICA公司产品。

2、实验方法

2.1溃疡性结肠炎大鼠模型构建、分组及处理

按参照文献[4]方法,用TNBS法构建溃疡性结肠炎大鼠模型,将建模成功的大鼠随机分为模型组和低、高剂量实验组,每组15只,正常组大鼠不进行干预。建模后48h,低、高剂量实验组灌胃100,200mg·kg-1·d-1丹参酮ⅡA,正常组与模型组则灌胃等量生理盐水,每天1次,连续干预7d。

2.2以ELISA法检测血清炎性因子含量[5]5]

末次药物干预后,各组大鼠均以乙醚吸入麻醉,眼球采血约3mL,以3000r·min-1离心10min,以ELISA法检测血清炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)及ROS、NOXs含量。严格按照试剂盒操作说明操作。

2.3以免疫组化法检测结肠组织IL-1β表达情况

采血结束后,断头处死各组大鼠,取出病变最显著的肠黏膜组织,按参照文献[6]处理,用免疫组化检测试剂盒检测病理组织中IL-1β蛋白表达情况,于倒置显微镜下观察并以Image-ProPlus多功能真彩色细胞图像分析管理系统分析肠黏膜组织中IL-1β分子表达情况。

2.4以蛋白质印迹法[7]7]及实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法[8]8]检测结肠组织p-p38MAPK、NOXs蛋白及mRNA表达

取保存于液氮中的大鼠结肠组织,经组织研磨、匀浆,制备组织匀浆液,并提取细胞总蛋白,进行蛋白浓度测定,参照相关文献检测方法检测组织p-p38MAPK、NOXs蛋白及mRNA的相对表达量。

3、统计学处理

用SPSS19.0软件进行统计分析。计量资料用x¯±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,2组间比较用LSD-t检验。

结果

1、各组血清因子含量比较

模型组血清IL-1β、IL-6及ROS、NOXs含量均较正常组显著升高,而实验组较模型组显著降低,高剂量实验组低于低剂量实验组(均P<0.05),见表1。

2、各组大鼠结肠组织IL-1β蛋白表达情况

免疫组化染色可见,正常组、模型组和低、高剂量实验组结肠组织IL-1β蛋白相对表达量分别为1.00±0.00,15.16±3.26,8.52±2.76,3.26±1.24;模型组结肠组织IL-1β表达较正常组显著升高,而实验组较模型组显著降低,高剂量实验组低于低剂量实验组(均P<0.05)。

3、结肠组织p-p38MAPK、NOXs蛋白及mRNA表达情况

模型组结肠组织p-p38MAPK、NOXs蛋白及mRNA表达较正常组显著升高,而实验组较模型组显著降低,高剂量实验组低于低剂量实验组(均P<0.05),见表2。

表1各组血清相关因子含量比较

表2各组结肠组织磷酸化-p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)、NADPH氧化酶(NOXs)蛋白及mRNA相对表达情况

讨论

丹参酮ⅡA不仅具有直接的抗菌作用,还可提高及调节机体免疫功能。本研究结果显示,实验组血清IL-1β、IL-6含量较模型组明显降低,且结肠组织中IL-1β蛋白表达量降低,证实丹参酮ⅡA可有效抑制溃疡性结肠炎大鼠炎性反应,降低组织炎性损伤。丹参酮ⅡA可有效抑制血清中ROS、NOXs的含量以及结肠组织中p-p38MAPK、NOXs基因的转录及蛋白的表达,进而发挥抑制促炎因子的表达的作用。

参考文献：

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