骨质疏松症（OP）是以骨量低下、骨组织微结构损坏，导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病。随着我国人口的老龄化，OP患病率逐年增加，最新调查显示，我国40岁以上人群的OP发病率高达24.62%[1]，其中绝经后骨质疏松症（PMOP）占比最大[2]。目前，西医治疗OP的基础用药有钙剂、维生素D以及雌激素等[2]，但长期使用副作用较多[3,4]。

中医药在防治OP上具有独特优势，但其多成分、多靶点的作用机制复杂，尚未完全阐明。淫羊藿具有补肾、健骨等功效，临床常用于治疗肾虚、筋骨萎软等症[5]。现有研究已明确，淫羊藿抗OP的主要有效成分是以淫羊藿苷为代表的黄酮类化合物[6]，其中淫羊藿总黄酮可促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨性分化[7]，并具有促进骨形成和抑制骨吸收的双重活性[8,9]，但其信号转导机制尚未明确。

相关研究显示，由骨形态发生蛋白（BMP）、Runt相关转录因子2(Runx2）、成骨细胞特异性转录因子（Osx）组成的BMP/RunX2/Osx信号通路与骨形成密切相关[10,11,12]，基于对淫羊藿的相关药理机制的研究[13]，笔者推测淫羊藿总黄酮可能是通过BMP/Runx2/Osx通路防治OP。本研究通过建立PMOP大鼠模型，探索淫羊藿总黄酮对其骨组织学和BMP/Runx2/Osx信号通路的影响，从而明确淫羊藿总黄酮防治OP的作用机制。

1、材料

1.1仪器

MK3型酶标仪（美国Bio-Rad公司）；ZF-208型凝胶成像系统（上海恒勤仪器设备有限公司）；PIDRed96型聚合酶链式反应（PCR）仪（美国ThermoFisherScientific公司）；RM2245型冰冻切片机（北京世贸远东科学仪器有限公司）；EG1150型包埋机、SM2000R石蜡滑动式切片机（德国Leica公司）；BX-2型光学显微镜（日本Olympus公司）；AllegraX-15R型医用离心机（美国Beckman公司）；DexaPro-1型双能X射线骨密度仪（美国GE公司）；JS-Power300型电泳仪（上海迪奥生物科技有限公司）；SkyScan1272型超高分辨率microCT系统（比利时Bruker公司）。

1.2药品与试剂

淫羊藿总黄酮（江苏康缘阳光药业有限公司，批号：20198954，纯度：>90%）；戊酸雌二醇片（廊坊高博京邦制药有限公司，批号：20191125，规格：2mg/片）；血清钙离子、骨钙素、Ⅰ型原胶原N端前肽（P1NP）酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，批号：ZN2797349、ZN27840113、ZN27528941）；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶试剂盒（批号：ED2036r）、羊抗鼠BMP多克隆抗体（批号：jx-2350）、羊抗鼠Runx2多克隆抗体（批号：jx-2056）、羊抗鼠Osx多克隆抗体（批号：jx-2752）、羊抗鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体（批号：jx-1379）、辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG）二抗（批号：jx-1943）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（批号：ED2582r）、实时荧光定量-PCR试剂盒（批号：ED37945r）均购自广州晶欣生物科技有限公司；苏木精、伊红染液（武汉科诺生物科技有限公司）；其余试剂均为分析纯或实验室常用试剂，水为蒸馏水。

1.3动物

50只健康成年SD大鼠，SPF级，雌性，6月龄，体质量为170～210g，由广州中医药大学实验动物中心提供[实验动物生产合格证号：SCXK（粤）2018-0034]。饲养环境温度为（22±2）℃、相对湿度为50%。本研究通过广州中医药大学动物实验中心伦理委员会批准。

2、方法

2.1分组、造模与给药

选取50只SD大鼠，适应性喂养1周后，按体质量分层法随机分为5组：假手术组，模型组，淫羊藿总黄酮低、高剂量组和雌二醇组，每组10只。除假手术组外，其余4组大鼠均采用卵巢摘除去势法建立PMOP模型[14]，具体操作为：用10%水合氯醛将大鼠麻醉后，在其腰椎棘突旁开1cm处，沿着皮肤和肌肉纵向剖离1.5cm左右的深度，在脂肪团中找到双侧卵巢并切除双侧卵巢；假手术组大鼠采用同样的手术操作暴露卵巢，但不摘除。术后腹腔注射青霉素（10万单位/d），连续3d。术后大鼠正常饲养，2个月后开始灌胃给药，每天给药1次，连续给药84d(12周）。其中，淫羊藿总黄酮低、高剂量组大鼠的给药剂量分别为265、530mg/（kg·d）[分别为成人（体质量以50kg计）临床用量的1、2倍等效剂量]，雌二醇组大鼠的给药剂量为0.09mg/kg[15]，假手术组和模型组大鼠均灌胃等量生理盐水，给药体积均为1mL/100g。

2.2大鼠股骨、椎骨骨密度（BMD）和股骨微结构检测

末次给药结束后24h，各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，将其右股骨、椎骨部位置于双能X线密度仪上检测BMD。将各组大鼠完整的股骨置于microCT系统上进行扫描，扫描完成后，通过EvaluationV6.5.3软件建模采集图像并对股骨微结构进行分析，采集骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分离度（Tb.Sp）等数据。

2.3大鼠血清中钙离子、骨钙素、P1NP水平检测

采用ELISA法进行检测。末次给药后1h从大鼠的腹主动脉取血5mL，放置1h后，以3000r/min离心10min，分离上层血清。分别按照ELISA试剂盒说明书操作，检测血清中钙离子、骨钙素、P1NP水平。

2.4大鼠股骨组织的病理学观察

采用苏木精-伊红（HE）染色法进行观察。取血后，将各组大鼠处死，取其左侧股骨，以10%甲醛固定，再用20%EDTA脱钙液进行脱钙，然后进行脱水（60min）；用二甲苯Ⅰ和Ⅱ进行透明（分别处理60min），常规浸蜡、包埋后进行组织切片（4µm）。行HE染色后，在光学显微镜下观察股骨的病理学变化。

2.5大鼠骨组织中BMP、Runx2、OsxmRNA表达情况检测

采用实时荧光定量-PCR法进行检测。取大鼠右侧股骨洗净，取部分骨片（另一部分保存于-80℃）。采用Trizol法提取其总RNA，确定其纯度和浓度后，将总RNA反转录合成cDNA，并以cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系（共20µL):SYBR荧光染料10μL，上、下游引物各2μL,cDNA模板4μL，无核酸酶水2μL。反应条件：94℃预变性5min;95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸1min，共40个循环。以GAPDH作为内参，采用2-ΔΔCt法计算各目标基因mRNA的表达水平（式中Ct表示荧光信号强度达到设定阈值时经历的循环次数）。引物由武汉擎科生物公司设计并提供，其引物序列及产物大小见表1。

表1引物序列及产物大小

2.6大鼠骨组织中BMP、Runx2、Osx蛋白表达情况检测

采用Westernblotting法进行检测。取冷冻保存的大鼠右股骨组织，每组随机取3个样本，用无菌眼科剪刀将其尽可能剪碎，置于研钵内研磨，加入裂解液使其充分裂解。裂解完毕后，以12000r/min离心15min，取上清液，用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。蛋白经变性后，取50µg进行SDS-PAGE电泳（140V），然后在300mA下转膜1h至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上；TBST缓冲液洗膜5min×3次；将膜放入5%的脱脂奶粉中，室温条件下封闭孵育2h；将膜取出后，用TBST缓冲液洗膜5min×3次；分别加入BMP、Runx2和Osx一抗（稀释度均为1∶1000),4℃孵育过夜；加入二抗（稀释度为1∶200），室温孵育1h；以ECL试剂盒显色后，置于凝胶成像系统上成像。采用ImageJv1.5.1软件进行分析，以目标蛋白条带灰度值与内参蛋白（GAPDH）条带灰度值的比值表示目标蛋白的表达水平。

2.7统计学方法

采用SPSS22.0统计学软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；若不符合正态分布，则采用非参数检验进行组间比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。

3、结果

3.1淫羊藿总黄酮对PMOP模型大鼠股骨、椎骨BMD的影响

与假手术组比较，模型组大鼠股骨、椎骨BMD显著降低（P<0.01）；与模型组比较，淫羊藿总黄酮低、高剂量组和雌二醇组大鼠股骨、椎骨BMD均显著升高（P<0.05或P<0.01）；与淫羊藿总黄酮低剂量组比较，淫羊藿总黄酮高剂量组和雌二醇组大鼠股骨BMD显著升高（P<0.05）；与雌二醇组比较，淫羊藿总黄酮高剂量组大鼠股骨、椎骨BMD差异均无统计学意义（P>0.05）。各组大鼠股骨、椎骨BMD测定结果见表2。

表2各组大鼠股骨、椎骨BMD测定结果

注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05,##P<0.01；与淫羊藿总黄酮低剂量组比较，ΔP<0.05

3.2淫羊藿总黄酮对PMOP模型大鼠股骨微结构的影响

与假手术组比较，模型组大鼠股骨Tb.N、Tb.Th显著降低（P<0.01),Tb.Sp显著升高（P<0.01）；与模型组比较，淫羊藿总黄酮低、高剂量组和雌二醇组大鼠股骨Tb.N、Tb.Th显著升高（P<0.05或P<0.01),Tb.Sp显著降低（P<0.05或P<0.01）；与淫羊藿总黄酮低剂量组比较，淫羊藿总黄酮高剂量组和雌二醇组大鼠股骨Tb.N、Tb.Th显著升高（P<0.05),Tb.Sp显著降低（P<0.05）；与雌二醇组比较，淫羊藿总黄酮高剂量组大鼠股骨Tb.N、Tb.Th显著升高（P<0.05),Tb.Sp差异无统计学意义（P>0.05）。各组大鼠股骨微结构microCT扫描图见图1,Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp测定结果见表3。

3.3淫羊藿总黄酮对PMOP模型大鼠血清中钙离子、骨钙素、P1NP水平的影响

与假手术组比较，模型组大鼠血清中钙离子、骨钙素、P1NP水平显著降低（P<0.01）；与模型组比较，淫羊藿总黄酮低、高剂量组和雌二醇组大鼠血清中钙离子、骨钙素、P1NP水平均显著升高（P<0.05或P<0.01）；与淫羊藿总黄酮低剂量组比较，淫羊藿总黄酮高剂量组和雌二醇组大鼠血清中钙离子、骨钙素、P1NP水平均显著升高（P<0.05）；与雌二醇组比较，淫羊藿总黄酮高剂量组大鼠血清中P1NP水平显著升高（P<0.05），血清中钙离子、骨钙素水平差异无统计学意义（P>0.05）。各组大鼠血清中钙离子、骨钙素、P1NP水平测定结果见表4。

图1各组大鼠股骨骨微结构microCT扫描图（三维重建图像，×100)

表3各组大鼠股骨Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp测定结果

注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05,##P<0.01；与淫羊藿总黄酮低剂量组比较，ΔP<0.05；与雌二醇组比较，★P<0.05

3.4淫羊藿总黄酮对PMOP模型大鼠股骨组织病理学的影响

与假手术组比较，模型组大鼠骨小梁组织结构紊乱，断裂明显，骨髓腔内部空洞较多；与模型组比较，淫羊藿总黄酮低、高剂量组和雌二醇组大鼠骨小梁数目增多、排列整齐，结构较为完整，其中以淫羊藿总黄酮高剂量组和雌二醇组改善较为明显。各组大鼠股骨组织病理学观察显微图见图2。

表4各组大鼠血清中钙离子、骨钙素、P1NP水平测定结果

注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05,##P<0.01；与淫羊藿总黄酮低剂量组比较，ΔP<0.05；与雌二醇组比较，★P<0.05

图2各组大鼠股骨组织病理学观察显微图（HE染色，×40)

3.5淫羊藿总黄酮对PMOP大鼠骨组织中BMP、Runx2、OsxmRNA表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠骨组织中BMP、Runx2、OsxmRNA的表达水平显著降低（P<0.01）；与模型组比较，淫羊藿总黄酮低、高剂量组和雌二醇组大鼠骨组织BMP、Runx2、OsxmRNA表达水平均显著降低（P<0.05或P<0.01）；与淫羊藿总黄酮低剂量组比较，淫羊藿总黄酮高剂量组和雌二醇组大鼠骨组织中BMP、Runx2、OsxmRNA表达水平均显著升高（P<0.05）；与雌二醇组比较，淫羊藿总黄酮高剂量组大鼠骨组织中Runx2、OsxmRNA表达水平均显著升高（P<0.05），但BMPmRNA表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。各组大鼠骨组织BMP、Runx2、OsxmRNA的表达水平测定结果见表5。

表5各组大鼠骨组织BMP、Runx2、OsxmRNA表达水平测定结果

注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05,##P<0.01；与淫羊藿总黄酮低剂量组比较，ΔP<0.05；与雌二醇组比较，★P<0.05

3.6淫羊藿总黄酮对PMOP模型大鼠骨组织BMP、Runx2和Osx蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠骨组织中BMP、Runx2、Osx蛋白表达水平均显著降低（P<0.01）；与模型组比较，淫羊藿总黄酮低、高剂量组和雌二醇组大鼠骨组织中BMP、Runx2、Osx蛋白表达水平显著升高（P<0.05或P<0.01）；与淫羊藿总黄酮低剂量组比较，淫羊藿总黄酮高剂量组和雌二醇组大鼠骨组织中BMP、Runx2、Osx蛋白的表达水平均上升（P<0.05）；与雌二醇组比较，淫羊藿总黄酮高剂量组骨组织中BMP、Runx2、Osx蛋白表达水平差异均无统计学意义（P>0.05）。各组大鼠骨组织中BMP、Runx2、Osx的蛋白表达电泳图见图3，蛋白表达水平测定结果见表6。

4、讨论

中医虽无OP的直接记载，但据OP的病因病机及临床症状可知，其与中医学的“骨痹”“骨痿”非常相似[16]。根据中医“肾主骨”的理论，肾精盛衰是诱发OP的重要因素[17]，故中医治疗多以补肾益精为主。西医治疗OP的方式主要包括给予雌二醇等骨吸收抑制剂[2]，故本研究以其为阳性药对照。淫羊藿总黄酮是补肾中药淫羊藿中的一种有效成分，以其为主要成分的制剂（如淫羊藿总黄酮胶囊）在临床上已用于OP的治疗。虽然有研究表明，淫羊藿总黄酮可以促进BMSCs的表达以及骨愈合和骨吸收[18]，但是具体相关药理机制尚未明确。

图3各组大鼠骨组织中BMP、Runx2、Osx蛋白表达的电泳图

表6各组大鼠骨组织中BMP、Runx2、Osx蛋白表达水平测定结果

注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05,##P<0.01；与淫羊藿总黄酮低剂量组比较，ΔP<0.05

BMP/Runx2/Osx信号通路与骨形成密切相关，参与调控成骨细胞的分化[19,20]。BMPs属于转化生长因子（TGF-β）超家族，可诱导BMSCs向成软骨细胞、成骨细胞等分化，促进成骨细胞功能。其中，BMP能通过与细胞膜表面的异二聚体受体特异性结合，调节Runx2及其下游Osx基因的转录和表达[21]。作为特异性成骨细胞转录因子和成骨细胞分化的关键调节因子，Runx2通过结合成骨细胞特异性顺式作用元件（OSE），激活骨桥素、骨钙蛋白、骨涎蛋白和Ⅰ型胶原基因等多种成骨细胞增殖、分化特异性标志物的转录和表达，促进膜内和软骨内骨化成骨[22]。而Osx属于锌指蛋白，是Runx2的下游关键性转录因子，通过调控许多成骨细胞重要晚期表型和功能蛋白的表达，促进BMSCs的成骨转化[23,24,25,26]。而在骨组织构建过程中，骨质的形成和吸收是同时发生的，骨构建过程处于失衡状态时，骨吸收显著高于骨形成，进而导致OP[27]。有细胞试验证实，BMP/Runx2/Osx信号通路参与了淫羊藿总黄酮促BMSCs定向成骨分化的进程，淫羊藿总黄酮能明显上调BMP-2的转录和表达[10]。

本研究结果显示，淫羊藿总黄酮可以升高PMOP模型大鼠股骨BMD、血清钙离子，股骨Tb.N和Tb.Th，降低股骨Tb.Sp，增多且增宽骨小梁，上调骨组织中BMP、Runx2、Osx的mRNA及其蛋白的表达。以上结果提示，淫羊藿总黄酮可以通过对BMP/Runx2/Osx信号通路的调控，从而升高骨骼BMD，增加骨形成，减少钙丢失以及改善骨小梁形态排列，从而降低或延缓OP的发生发展。

综上所述，淫羊藿总黄酮可通过上调股骨中BMP、Runx2、Osx的mRNA和蛋白表达，增加BMD和骨小梁的数量，改善股骨微结构，提高血清中钙离子、骨钙、P1NP的水平，从而修复骨构建失衡，起到防治OP的作用。但由于中药对机体或者细胞具有多途径、多靶点作用的特点，BMP/Runx2/Osx信号通路未必是淫羊藿总黄酮防治OP的唯一途径，此过程中还可能有其他信号转导通路的参与，故其具体的分子机制仍需进一步深入研究。

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基金:国家自然科学基金资助项目(No.8177151024).