下瘀血汤出自东汉张仲景的《金匮要略·妇人产后病脉证治》,由大黄、桃仁、虫三味中药组成,是近年来中医抗肝纤维化的经典方剂。陈少丽等[1]选用大黄素、苦杏仁苷替代大黄、桃仁,再与虫提取物配伍,发现下瘀血汤全方及组分配伍均可抑制α-SMA等纤维化因子表达,且全方组优于组分配伍组,提示下瘀血汤全方具有组分配伍无可替代的功效。我们的研究结果显示,下瘀血汤抗肝纤维化的机制主要有抑制肝星状细胞活化[2,3]、抑制肠上皮细胞凋亡和胰腺星状细胞活化等[4,5]。但下瘀血汤对急性肝损伤是否有抑制作用,尚未见文献报道。

急性肝损伤是临床的常见疾病,其病情进展比较迅速,严重者可致不可逆转的肝衰竭;主要的诱发因素有外伤、病毒或者酒精等,但机制并不清楚。脂多糖诱导是经典的急性肝损伤模型的制备方法,然而在LPS诱导急性肝损伤的过程中中性粒细胞发挥何种作用及下瘀血汤对其是否有干预作用尚无报道。

本研究以LPS诱导急性肝损伤为载体,从中性粒细胞浸润、炎症及趋化因子为切入点,探讨下瘀血汤对急性肝损伤的干预作用。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1动物

雄性C57BL/6小鼠,清洁级,24只,6～8周龄,体质量20g左右;购自上海斯莱克实验动物公司,动物生产许可证号:SYXK(沪)2017-0005。小鼠饲养于上海中医药大学附属普陀医院实验动物中心。

1.1.2药物与试剂

下瘀血汤所含的大黄(掌叶大黄,青海)、桃仁(山西)、虫(江苏)均购自上海华宇药业,由上海中医药大学附属曙光医院制备。具体制备方法:大黄2.0kg、桃仁2.0kg和虫1.2kg,各自制成粗粉,分别加入8倍量20%乙醇浸泡1h后混合;回流提取2次,先加20%乙醇回流提取30min,过滤收药汁;药渣再加6倍量20%乙醇回流提取1h,过滤收药汁。合并两次所收药汁,真空干燥称重为0.585kg,每克所含生药量为8.889g,临用前配制成浓度为0.63g/mL的下瘀血汤药液[6]。

LPS,美国Sigma公司(批号:L2880);SABC组化试剂盒,德国Vector公司(批号:PK6100);MPO(批号:ab208670)、CXCL15(批号:ab197016)抗体,英国Abcam公司;RNA提取试剂TRIzol(批号:9109)、cDNA反转录试剂盒(批号:RR037A)及SYBR(批号:RR420),均购自日本Takara株式会社;DAB,北京中杉金桥(批号:ZLI-9018);引物(TNF-α、IL-6、MCP-1、CXCL2、CCL3、CXCR1),上海生工。

1.1.3仪器

超声波粉碎机,宁波新芝(型号:JY92-II);酶标仪,美国Thermo公司(型号:VarioskanLUX);分光光度计,德国TitertekBerthold公司(型号:Colibri);PCR仪,美国Bio-Rad公司(型号:T100);实时荧光定量PCR仪,美国ABI(型号:VIIA7DX);脱水机,德国Leica公司(型号:TP1020);包埋机,德国Leica公司(型号:EG1150H);切片机,德国Leica公司(型号:RM2245);染色机,德国Leica公司(型号:ST5010);封片机,德国Leica公司(型号:CV5030);荧光显微镜,日本Olympus(型号:BX43)。

1.2分组

24只雄性C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组和下瘀血汤组,每组8只。

1.3造模与干预

下瘀血汤组灌胃给予下瘀血汤药液(0.4678g/kg,相当于75kg成人体质量的10倍量)[7,8],正常组和模型组给予等量的双蒸水。4h后下瘀血汤组和模型组小鼠给予LPS(10mg/kg)腹腔注射[9],18h后2%戊巴比妥钠麻醉小鼠,开腹,下腔静脉取血,留取肝组织。

1.4检测指标与方法

1.4.1一般情况

实验过程中观察各组小鼠的存活情况,记录有无死亡。

1.4.2血清ALT和AST水平

小鼠下腔静脉取血,静置2～3h,4℃,3000r/min离心,取血清。送上海中医药大学附属普陀医院检验科检测ALT和AST水平。

1.4.3肝组织病理学改变

肝组织于10%中性福尔马林固定,乙醇脱水,二甲苯透明、包埋、切片,HE染色后观察肝组织病理学改变。采用OlympusBX43显微镜以及CellSenStandard9.0软件和OlympusDP72拍照系统,随机取4个视野采集图片。

1.4.4MPO、CXCL15表达

采用免疫组化检测MPO、CXCL15表达。小鼠肝组织石蜡切片脱蜡至水,PBS洗3次,微波修复抗原,滴加3%过氧化氢溶液,37℃孵育15min;PBS清洗3次,每次3min;滴加5%BSA,37℃封闭,30min;滴加MPO和CXCL15抗体(按照说明书效价配置),37℃条件下孵育1h;PBS清洗;二抗在37℃条件下孵育30min;PBS清洗;滴加SABC试剂,37℃条件下孵育30min;PBS清洗3次;DAB显色液;苏木素染色15s,充分冲洗;无水乙醇中脱水5min;二甲苯透明5min;封片,显微镜下观察。采用Image-proplus6.0软件对MPO和CXCL15阳性表达面积进行统计和分析。

1.4.5相关炎症因子及趋化因子表达

采用Real-timePCR检测相关炎症因子TNF-α、IL-6及趋化因子MCP-1、CXCL2、CCL3、CXCR1的表达。

总RNA提取:TRIzol法提取肝脏RNA,将提取的总RNA溶解于DEPC水,测RNA浓度。逆转录:按Takara逆转录试剂盒(RR037A)说明书进行。以18s为内参,扩增引物由引物原液与灭菌水合成。PCR引物序列见表1。反应条件:37℃、15min,85℃、5s,4℃、15min。扩增:取cDNA3μL加SYBRGreen5μL,上游引物0.4μL,下游引物0.4μL,ddH2O1.2μL,制成10μL体系,条件为:95℃、30min预变性;95℃、5s变性,60℃、30s退火,40个循环,60℃、1min延伸。PCR结束采用2-ΔΔCt法分析计算目的基因表达。

表1引物序列下载原表

表1引物序列

1.5统计学方法

实验数据采用SPSS23.0软件进行统计学分析。计量资料比较采用t检验或单因素方差分析(one-wayANOVA);组间比较正态分布者采用最小显著差异检验法(SNK或LSD-t)。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1小鼠一般状况

造模18h后,小鼠无死亡。正常组小鼠状态良好,行动正常。模型组小鼠精神萎靡不振,行动迟缓,反应能力降低。下瘀血汤组小鼠状态较模型组好,反应力未明显降低。

2.2对血清ALT和AST水平的影响

与正常组比较,模型组血清ALT和AST水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,下瘀血汤组血清ALT和AST水平显著降低(P<0.05)。提示下瘀血汤对LPS诱导肝功能损伤具有保护作用。见图1。

图1各组ALT和AST水平比较

注:A.正常组;B.模型组;C.下瘀血汤组;与正常组比较,**P<0.01,***P<0.001;与模型组比较,#P<0.05,##P<0.01;n=8。

2.3肝组织病理学改变

HE染色显示,正常组肝小叶结构完整。模型组肝细胞变性、坏死严重,并伴有大量的炎细胞浸润,提示LPS诱导急性肝损伤模型成功。与模型组相比,下瘀血汤组坏死以及炎细胞浸润显著减轻,与半定量分析统计结果一致,提示下瘀血汤对LPS诱导的急性肝损伤具有抑制作用。见图2、图3。

2.4对MPO、CXCL15表达的影响

免疫组化结果显示,正常组MPO阳性很弱。模型组MPO阳性表达显著增多(P<0.001)。与模型组比较,下瘀血汤组MPO阳性显著降低(P<0.001),表明下瘀血汤对LPS诱导的肝损伤小鼠中性粒细胞浸润有显著抑制作用。见图4、图5。

图2各组肝组织病理学情况(HE染色,×400)

注:A.正常组;B.模型组;C.下瘀血汤组。

图3各组肝组织HE染色的半定量分析

注:A.正常组;B.模型组;C.下瘀血汤组;与正常组比较,***P<0.001;与模型组比较,###P<0.001;n=8。

免疫组化结果显示,正常组CXCL15阴性;模型组CXCL15阳性显著增多(P<0.001);与模型组比较,下瘀血汤组CXCL15阳性显著降低(P<0.001),提示下瘀血汤对LPS诱导的肝损伤小鼠CXCL15上调有显著抑制作用。见图6、图7。

2.5对相关炎症因子及趋化因子表达的影响

与正常组比较,模型组炎症因子TNF-α和IL-6mRNA表达显著升高(P<0.01)。与模型组比较,下瘀血汤组炎症因子TNF-α和IL-6mRNA表达显著降低(P<0.001,P<0.01)。表明下瘀血汤对急性肝损伤的炎症升高有显著的抑制作用。见图8。

图4各组MPO表达情况(免疫组化染色,×400)

注:A.正常组;B.模型组;C.下瘀血汤组。

图5各组MPO半定量分析

注:A.正常组;B.模型组;C.下瘀血汤组;与正常组比较,***P<0.001;与模型组比较,###P<0.001;n=8。

与正常组比较,模型组趋化因子MCP-1、CCL3、CXCR1及CXCL2mRNA表达均显著升高(P<0.01,P<0.001)。与模型组比较,下瘀血汤组趋化因子MCP-1、CCL3、CXCR1及CXCL2mRNA表达明显抑制(P<0.01,P<0.001)。见图8。

3、讨论

急性肝损伤是临床常见疾病,其病情发展迅速,严重者会导致不可逆转的肝衰竭。研究表明,中药在治疗肝损伤方面具有积极作用[10]。因此,从中医经典方剂中寻找治疗急性肝损伤安全、有效的药物显得至关重要。

图6各组CXCL15表达情况(免疫组化染色,×400)

注:A.正常组;B.模型组;C.下瘀血汤组。

图7各组CXCL15表达的半定量分析

注:A.正常组;B.模型组;C.下瘀血汤组;与正常组比较,***P<0.001;与模型组比较,###P<0.001;n=8。

下瘀血汤出自张仲景的《金匮要略·妇人产后病脉证治》,由大黄、桃仁、虫组成,主治瘀阻腹痛及瘀血阻滞、腹中癥块等。研究发现,下瘀血汤中含有大黄素、大黄酸、苦杏仁苷等多种有效抗肝纤维化的活性成分[11,12],是治疗肝纤维化的经典方剂[13,14]。除此之外,下瘀血汤对免疫细胞和炎症因子有显著调节作用,如对LPS诱导RAW264.7产生TNF-α有抑制作用[15],可通过调控巨噬细胞的NLRP6表达抑制非酒精性脂肪性肝炎[8]。但下瘀血汤对急性肝损伤的治疗作用以及对中性粒细胞所分泌的趋化因子表达尚待研究。

图8各组炎症因子、趋化因子的mRNA表达情况比较

注:A.正常组;B.模型组;C.下瘀血汤组;与正常组比较,**P<0.01;***P<0.001;与模型组比较,##P<0.01;###P<0.001;n=8。

在LPS诱导急性肝损伤经典模型中,炎性细胞释放炎症因子与趋化因子,促进肝细胞坏死与凋亡[16];然而,既往研究多关注于LPS诱导肝细胞凋亡[17]、KC活化[18]及NF-κB信号通路[19],对肝脏中性粒细胞影响的研究则相对较少。中性粒细胞是固有免疫系统重要的效应细胞[20]。机体感染病原体后,中性粒细胞聚集到感染位点并分泌CXC趋化因子配体、CC趋化因子配体等,同时与巨噬细胞相互作用,刺激巨噬细胞释放TNF-α、IL-6[21]。MPO是中性粒细胞的标志物,其表达情况可直接反映炎症的程度[22],有报道显示CXCL15可增强中性粒细胞的趋化性[23]。本研究免疫组化结果显示,LPS处理后MPO及CXCL15表达明显升高,提示LPS诱导了中性粒细胞浸润。实时定量PCR结果显示,LPS处理后TNF-α、IL-6炎症因子及MCP-1、CXCL2、CCL3、CXCR1趋化因子水平显著升高,下瘀血汤可显著抑制肝组织中炎症因子及趋化因子表达,表明下瘀血汤通过抑制中性粒细胞浸润从而改善LPS诱导的急性肝损伤。

一般认为下瘀血汤适应证应具有慢性“血瘀”疾病特征,这可能是下瘀血汤很少被用于急性肝损伤的原因之一。本研究基于肝功能和组织病理学整体判断,发现下瘀血汤可显著抑制急性肝损伤的形成。急性肝损伤时,炎症、内毒素等致病因子迅速上调,而润肠通便、保肝是临床常用的治疗手段,下瘀血汤中大黄和桃仁具有通便排毒、柔肝降酶作用[24,25],这可能是下瘀血汤在本研究中取效的物质基础。然而,我们研究亦存在诸多不足:如无阳性对照药物,缺乏剂量效应关系观察及不清楚虫在急性损伤中的作用等,这些都有待未来进一步深入探讨。

综上,本研究结果表明,下瘀血汤可显著抑制LPS诱导的急性肝损伤,其机制可能与抑制中性粒细胞浸润有密切关系。

参考文献:

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[8]吴柳,张洁,马文婷,等.下瘀血汤对胆碱蛋氨酸缺乏诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝炎的抑制作用[J].中国肝脏病杂志(电子版),2018,10(3):54-61.

[10]有曼,李瑞芳,高子涵,等.柴胡皂苷b2对LPS/GalN诱导的小鼠急性肝损伤炎症和能量代谢的影响[J].中国中药杂志,2019,44(14):2966-2971.

[15]都广礼,陈德兴,韩琳,等.下瘀血汤含药血清对脂多糖诱导活化的RAW264.7细胞表达MMP2,9/TIMP1,2的调控作用[J].上海中医药大学学报,2010,24(3):56-59.

[20]念学武,孙二琳,韩瑞发.中性粒细胞免疫调节作用的研究进展[J].国际免疫学杂志,2014,37(5):394-397.

[24]张志芳,董秋梅.通腑活血法及其类方研究初探[J].中医杂志,2015,56(9):749-752.

[25]都广礼,陈德兴,张艳,等.肝纤维化大鼠肝组织基质金属蛋白酶9及其抑制因子1基因表达的动态变化及下瘀血汤对其影响[J].中国中西医结合消化杂志,2010,18(1):1-4.

杨广越,陶乐,沈东晓,马文婷,张玮,吴柳,刘成.下瘀血汤调控中性粒细胞浸润抑制脂多糖诱导肝损伤机制[J].上海中医药杂志,2020,54(10):87-92.

基金:国家自然科学基金项目(81673788､81873136);上海中医药大学中医学高峰学科项目(A-U151902);上海中医药大学普陀医院项目(2016204B､2017207A);上海市普陀区自主创新项目(ptkwws201817､ptkwws201904).