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甲型流感病毒荧光RT-RAA检测方法的建立

2024-12-20 107 上传者：管理员

摘要：目的利用逆转录-重组酶介导等温扩增技术（reverse transcription recombinase-aided isothermal amplification,RT-RAA）建立一种甲型流感病毒（Influenza A virus）的快速检测方法。方法首先在美国国家生物技术信息中心NCBI上检索甲型流感病毒的基因序列，利用DNAstar软件进行序列对比，针对保守M基因设计3对引物及1条荧光探针，建立甲型流感病毒荧光RT-RAA检测方法，并对建立的方法进行特异性、灵敏性、重复性试验以及临床样本的检测。结果成功筛选出1对扩增效果好的引物及探针，建立了快速检测甲型流病毒感的荧光RT-RAA方法。该方法在42℃条件下恒温扩增20 min就能完成检测，最低可检测到3.18×10～0拷贝/μl甲型流感病毒重组质粒，与乙型流感病毒、新冠病毒、登革病毒均无交叉反应。用商品化试剂盒与本研究建立的荧光RT-RAA方法检测20份甲型流感病毒核酸阳性临床样本，两种方法的符合率为100%。结论成功建立了快速检测甲型流感病毒的荧光RT-RAA方法，具有较好的特异性、灵敏性，为甲型流感病毒检测提供了新方法。

关键词：
检测
甲型流感病毒
糖蛋白
血凝素
重组酶介导等温扩增
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甲型流感病毒（Influenza A virus）是医学上一种重要的病毒，目前仍在全球各个地区造成重大死亡和发病率[1]。甲型流感病毒属于正黏病毒科的负链RNA病毒[2]，基因组分为8个节段（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS），编码11个病毒蛋白[3]。根据血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）这两种表面糖蛋白将其分为多种亚型，目前，全世界已确定16种HA和9种NA亚型[4]，所有HA和NA亚型均已从野生鸟类中分离出来，人类和其他哺乳动物的感染仅限于少数亚型[5]。甲型流感病毒的宿主范围广泛，猪、猫、鲸、禽类以及人体均可检出[6]，是一种危害极大的人畜共患呼吸道病毒，建立快速检测方法对防控尤为重要。

甲型流感病毒的诊断方法主要有病毒分离培养、免疫荧光法、流式细胞仪法、实时荧光聚合酶链反应（Real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）等[7]，重组酶介导等温扩增技术（recombinase-aided isothermal amplifification,RAA）是一种新型等温扩增技术，不需要复杂的温度设置，在37～42℃恒温条件下就能扩增[8]，相较于其他检测技术，具有操作方法简单、灵敏度高、扩增时间短等优点[9-10]。

本研究利用逆转录-重组酶介导等温扩增技术（reverse transcription recombinase-aided isothermal amplification,RT-RAA）建立了通用型甲型流感病毒的快速检测方法，可在20 min内完成检测，有效缩短检测时间，可检测甲型流感病毒的所有亚型，为甲型流感病毒的检测提供了一种新方法。

1、材料与方法

1.1毒株和样本

甲型流感病毒、乙型流感病毒(Influenza B virus）、新型冠状病毒（SARS-CoV-2）、登革病毒（Dengue virus,DENV）核酸、20份甲型流感病毒核酸由青岛国际旅行卫生保健中心实验室保存。

1.2引物及荧光探针设计

在NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov）检索甲型流感病毒基因序列，用DNAstar软件进行序列比对，选择较保守的M基因设计引物和荧光探针，并利用Primer-BLAST软件（www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer?blast/）验证引物序列特异性。引物和探针均由生工生物工程（上海）有限公司合成。具体信息见表1。

表1本研究设计的甲型流感病毒引物和荧光探针序列

1.3重组质粒的制备

将扩增的目的基因片段克隆至pUC57载体，制备重组质粒，计算拷贝数（拷贝/μl)=[6.02×1023×质量浓度（mg/L）×10-9]/（片段长度×660）。重组质粒由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.4 R T-R AA反应体系及反应条件

根据RT-RAA核酸扩增试剂盒（荧光型，杭州众测生物科技有限公司）说明书配制反应体系，其中（10μmol/L）引物共4μl、（10μmol/L）探针0.6μl、模板5μl，加到反应干粉中吹打混匀，上机检测。反应条件为：42℃40 s;42℃30 s,40个循环。

1.5特异性试验

利用乙型流感病毒、SARS-CoV-2、DENV的核酸验证本研究建立方法的特异性，去离子水为阴性对照。

1.6灵敏性试验

计算出重组质粒浓度为3.18×109拷贝/μl,10倍梯度稀释。用3.18×105～3.18×100拷贝/μl的重组质粒进行灵敏性试验，去离子水为阴性对照。

1.7重复性试验

用3.18×105拷贝/μl的重组质粒重复检测4次，去离子水为阴性对照，评价方法的重复性。

1.8临床样品的检测

应用上海之江生物科技有限公司生产的甲、乙型流感病毒联合测定试剂盒（荧光PCR法）与本研究建立的荧光RT-RAA方法分别检测20份甲型流感病毒临床样本核酸，比较两种方法的一致性。

2、结果

2.1引物和探针筛选

将设计的3对引物和1条荧光探针进行组合，扩增3.18×105拷贝/μl的重组质粒。3对引物和探针组合均出现明显扩增曲线，其中引物FLU A-F1/R1出峰时间最早，引物FLU A-F2/R2荧光信号最强（图1）。确定出峰时间较早、荧光信号最强的引物FLU A-F2/R2进行后续试验。

图1甲型流感病毒荧光RT-RAA的引物筛选

注：1.引物FLU A-F1/R1;2.引物FLU A--F2/R2;3.引物FLU A-F3/R3;4.阴性对照。

2.2特异性试验

用本研究建立的荧光RT-RAA方法检测重组质粒、乙型流感病毒、SARS-CoV-2、DENV核酸。结果如图2所示，除甲型流感病毒重组质粒外其他病毒均未出现扩增曲线，表明建立的方法具有良好的特异性。

图2甲型流感病毒荧光RT-RAA方法的特异性验证

2.3灵敏性试验

以浓度为3.18×105～3.18×100拷贝/μl的重组质粒为模板进行灵敏性试验。结果如图3所示，建立的荧光RT-RAA方法最低检出浓度为3.18×100拷贝/μl的甲型流感病毒重组质粒，具有较好的灵敏性。

图3甲型流感病毒荧光RT-RAA检法的灵敏性验证

2.4重复性试验

用3.18×105拷贝/μl的甲型流感病毒重组质粒为模板进行4次组内的重复性试验，结果如图4所示。重组质粒均出现扩增曲线，且起峰时间和最高峰值都差异较小，表明具有较好的重复性。

图4甲型流感病毒荧光RT-RAA方法的重复性验证

2.5临床样本检测

分别用本研究建立的荧光RT-RAA方法与商品化试剂盒检测20份甲型流感病毒核酸，两种方法均检出20份阳性，符合率100%。但荧光RT-RAA方法比商品化试剂盒检测时间更短，在20 min内完成检测，和商品化试剂盒所需75 min相比，大大提高了检测效率，并且操作更加简便。

3、讨论

甲型流感病毒不仅能感染动物，导致宿主动物死亡，还能够感染人类，在人群中流行，甚至可引起流感大流行[11]。常用的检测方法主要是胶体金免疫层析和实时荧光定量RT-PCR法[12]，胶体金法简便快速，但敏感性较低，可能漏检；某些特殊类型流感病毒变异株无法检测出来[13]。实时荧光定量RT-PCR灵敏度高且能区分不同亚型，但需要扩增仪和专业技术人员，且扩增时间较长，不适用于资源有限的基层。

RAA作为一种快速检测技术，其原理主要是利用重组酶、单链DNA型结合蛋白（SSB）和引物形成复合体后对双链DNA扫描；识别同源序列并插入DNA使其解旋；SSB单链结合DNA防止复性，之后在dNTPs和ATP存在情况下，由DNA聚合酶完成链的延伸[14]。和荧光定量PCR相比，RT-RAA不需要升温降温的过程，只需42℃20 min即可完成检测，缩短了检测时间，对于疫情的防控和诊断有着重要意义。

本研究应用荧光RT-RAA技术成功建立甲型流感病毒快速检测方法，检测时间短、设备依赖性小、操作简便，与乙型流感病毒、SARS-CoV-2、DENV无交叉反应，具有良好的特异性，最低可检测到3.18×100拷贝/μl的甲型流感病毒重组质粒，拥有较好的重复性，为甲型流感病毒的检测提供了新方法，具有较好的应用前景。

参考文献:

[2]李周平,刘音,薛晓艳.甲型流感病毒研究回顾及进展[J].中国合理用药探索,2023,20(3):1-12.

[3]赖永洁,李靖.禽流感病毒对人类致病的研究概述[J].饲料与畜牧,2017(20):20-22.

[4]鲁冠杰,褚秀玲,苏建青,等.浅论流感病毒与公共卫生[J].畜禽业,2017(4):5-6.

[6]王秀荣,陈化兰.流感病毒对人类和畜牧业健康的影响[J].中国农业科学,2015,48(15):3038-3039.

[7]胡瑞,张艳亮,张娟.甲､乙型流感病毒检测方法的研究进展[J].系统医学,2023,8(2):178-182+198.

[10]禹兰平,王楷宬,潘俊慧,等.等温扩增技术概述及其在动物病原检测中的应用[J].中国动物检疫,2022,39(12):96-103.

[11]朱闻斐,杨磊,王大燕.人感染动物源性流感病毒病原学研究进展[J].中国热带医学,2024,24(1):18-21.

[12]安柏霖,郭悦,刘丹丹,等.逆转录重组酶介导的等温扩增技术快速检测甲型H1N1流感病毒[J].病毒学报,2023,39(1):45-51.

[13]胡瑞,张艳亮,张娟.甲､乙型流感病毒检测方法的研究进展[J].系统医学,2023,8(2):178-182+198.

[14]孙晓红,后来旺,李达容,等.重组酶等温扩增技术在分析检测中的应用研究进展[J].食品与发酵工业,2020,46(24):265-270.

基金资助:山东省重点研发计划项目(2021CXGC011306);