在各种膀胱炎中,膀胱上皮屏障出现不同程度的功能障碍,随着膀胱上皮细胞生物学不断发展,上皮屏障和膀胱炎的关系引起了广泛的关注与研究。

1、膀胱上皮屏障的结构

膀胱上皮由3个不同的细胞层组成,由内到外分别为浅层、中间层与基底层[1]。尽管膀胱上皮是多层的,但其发挥屏障作用的主要结构是最浅层的伞状细胞层,它包括伞状细胞顶膜腔面结构、其表面的糖胺聚糖层(glycosaminoglycans,GAGs)和伞状细胞之间的紧密连接(tightjunctions,TJ)[2],而TJ与伞状细胞顶膜一起形成了对尿液中离子、分子以及病原体的高阻力屏障[3]。有研究发现,在膀胱炎中,膀胱上皮屏障通透性的升高,可能与上皮细胞的变化直接相关[4]。

1.1糖胺聚糖层

糖胺聚糖层(GAGs)位于伞细胞顶膜表面,主要成分包括硫酸软骨素、透明质酸、硫酸肝素、硫酸皮肤素和硫酸角蛋白。一开始,GAGs被认为是膀胱上皮屏障功能的主要来源,有研究者将硫酸鱼精蛋白注入膀胱,从而破坏上皮表面的GAGs,观察到了膀胱上皮对Ca2+,尿素和水的通透性增加,推测GAGs形成了膀胱上皮屏障,阻止了尿液溶质与毒素进入膀胱间质[5]。但这一假说从开始就受到了质疑,原因在于硫酸鱼精蛋白会导致整个伞细胞层的分离,而不是单单破坏了GAGs[6],并且GAGs本身也不会形成水流动或离子渗透的屏障。不过GAGs具有非特异性的、抗粘连的功能在防止细菌感染方面得到了证实[7],GAGs是膀胱黏膜屏障的一部分,并且在间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征中,GAGs或许能为临床提供一些新思路。

1.2伞细胞顶膜腔面结构

伞细胞层是膀胱内面最浅层的细胞,它的顶膜由尿空班蛋白(ueoplakins,UPs)构成,在膀胱中主要有4个亚型,分别为UPⅠa(27kDa)、UPⅠb(28kDa)、UPⅡ(15kDa)、UPⅢa(47kDa)[8]。4种蛋白以二聚体(UPⅠa/UPⅡ和UPⅠb/UPⅢa二聚体)形式结合成为四聚体,再由6个四聚体组成约16nm的颗粒,它们相互连接形成斑块,这些斑块覆盖了70%～90%的伞细胞顶膜,也就形成了顶膜与胞质面的不对称膜(asymmetricunitmembrane,AUM)[9]。在敲除了编码UPⅢa的基因的小鼠体内,膀胱上皮对水和尿素的渗透性显著增加[10],这证明了完整的尿空斑蛋白斑块有助于建立膀胱上皮的黏膜屏障。有研究发现,AUM赋予了伞细胞顶膜的高度变形性,甚至比红细胞膜更容易变形,这种变形性是膀胱在充盈和排空期间,维持屏障功能必不可少的[11]。因此,UPs与斑块的正常表达和定位是判断上皮屏障功能的特征之一。

1.3TJ

TJ位于相邻伞细胞的顶端,下层依次是黏附链接与桥粒连接,三者共同构成了顶端连接复合体,参与调节上皮细胞之间的黏附与细胞旁运输[12]。使用冰冻断裂电子显微镜,显示TJ由网状的跨膜链组成。这些跨膜颗粒主要由跨膜蛋白组成,在胞外与相邻细胞的跨膜蛋白相互作用,消除细胞间的空隙,又在胞内与接头蛋白和细胞骨架蛋白相互连接锚定,形成了对细菌、病毒以及各种抗原的基础屏障[13]。

跨膜链的主要蛋白质成分是Claudin家族和3个蛋白相连而成的MAEVEL结构域:Occludin,tricellin(也称为MARVELl结构域相关蛋白2(MARVEL2)和MARVEL3。跨膜蛋白Claudins是一种四次跨膜蛋白,在人体中包含26个成员,在小鼠中包含27个成员,它们具有相似的拓扑结构,并且有一个共同属性就是细胞旁密封功能,即对物质大小、电荷的选择性[14,15],正是这一特性,使得Claudins成为了跨膜链的结构和功能单位,也构成了TJ的功能骨架。另一个重要的跨膜蛋白Occludin,由Furuse等[16]发现并克隆成功,这是TJ分子水平研究的一次重大进步,Occludin能够与TJ中的许多蛋白相互作用(ZO-1、ZO-2、Z0-3、JAM等),磷酸化/去磷酸化的Occludin在调节TJ通透性中起着关键作用[17]。目前认为,Claudin家族与Occludin共同参与调节TJ的通透性,当Claudin或Occludin的表达升高或者降低时,上皮屏障的通透性也相应得到增强或者减弱[18]。其他跨膜蛋白还有连接黏附分子(JAMs)以及免疫球蛋白(Ig)类型的黏附蛋白。

TJ的接头蛋白包括ZOs、MAGI、MUPP1、Cingulin等,是TJ结构稳定的基础,目前研究较多集中在ZOs蛋白,ZOs也是第一个被证实的TJ相关蛋白,属于MAGUK家族,有3个成员,及ZO-1、ZO-2、ZO-3。其中又以ZO-1与TJ的关系最为密切,ZO-1这个外周膜蛋白分子质量约220kDa,在N-端,它的第一个PDZ结构域与Claudins结合,第3个PDZ结构域与JAMs结合,GUK结构域和Occudin结合,而在C-端,ZO-1又与丝状肌动蛋白相互作用,从而稳定TJ,对TJ的正常结构起到支架作用[19]。在接头处,存在许多不同的信号蛋白,包括蛋白激酶、小GTP结合蛋白(RhoGTPases)、转录因子以及转录后调节因子,在信号传导中起着重要作用。

TJ能调节离子和其他分子选择性地通过间隙的细胞旁扩散。目前已经证明,TJ对上皮细胞维持屏障功能起决定性作用,当TJ破坏或缺失时,上皮细胞会受损、萎缩甚至发生上皮间充质转化(EMT),这些改变直接导致毒素与各种炎性因子进一步侵袭固有层,各种疾病随之发生。TJ具有选择分子电荷和大小的特性,离子的渗透方式被认为是穿过屏障中的孔隙,跨膜蛋白的Claudin家族,它们能基于通道和屏障的特殊性质表现出不同的离子选择性,例如Claudin2、Claudin10b、Claudin15具有阳离子选择性,Claudin10a和Claudin17具有阴离子选择性[20]。同源模型更加确定了这一发现,阳离子选择性跨膜蛋白Claudin2具有类似负电荷掌状表面,而阴离子选择性跨膜蛋白Claudin10a具有正电荷表面,根据Claudin蛋白的亚型,TJ要么形成一道严格的屏障,阻止溶质的细胞旁扩散,要么囊括了具有明显电荷选择性的细胞旁离子通道[21]。虽然对TJ渗透机制有了长足的进展,但对于Claudin如何影响孔隙的开放以及大分子的渗透机制仍然有待确定。

2、膀胱炎与上皮屏障

2.1细菌性膀胱炎中上皮屏障的变化

单纯的细菌性膀胱炎,即膀胱结构与功能正常的细菌感染,通过适当的治疗,绝大多数能获得成功的治疗。而在尿路结构或功能异常的膀胱炎中,如尿路畸形、梗阻、神经功能障碍等导致的膀胱炎[22],往往会出现反复的尿路感染或膀胱功能障碍。临床上通过单纯的药物治疗难以取得满意的疗效,而若控制不及时,膀胱便会出现不可逆的损伤。

细菌性膀胱炎最常见的病原体是尿路致病性大肠杆菌(uropathogenicescherichiacoli,UPEC),有研究者利用Ussing小室用致病性大肠杆菌在外对膀胱组织进行感染,证明了UPEC感染导致了伞细胞间TJ的破坏、伞细胞脱落、细胞旁渗透性的上升,此外,UPEC与上皮细胞的相互作用也促进了上皮细胞分泌细胞因子,包括TNF-α、IL-6与IL-15[23]。UPEC的Ⅰ型菌毛,对其在伞细胞上的定植、侵袭是必不可少的[24],Ⅰ型菌毛的远端具有黏附素FimH,它能识别宿主的α1、β3整合素蛋白与糖基化的尿空斑蛋白(UPs)[25],从而介导对伞细胞的定植与入侵[26]。Ⅰ型菌毛与伞细胞表面的黏附,启动了信号通路蛋白RhoGTPases(如Rho、CDC42、Rac),诱导伞细胞的肌动蛋白发生重排,进而使细菌入侵到细胞的内部[27],对抗生素的治疗产生了极大的阻碍。进入细胞的细菌藏匿在细胞质中繁殖,形成了细胞内菌落(intracellularbactericalcommunities,IBCs)[28],成熟后细菌便分散,继续入侵其他细胞。同样,UPEC的细胞毒素坏死因子Ⅰ与伞细胞膜上的细胞黏附分子基底受体结合[29],启动RhoGTPases通路,引起细胞骨架蛋白重排,对宿主细胞的重塑起到重要作用。UPEC还会释放溶血毒素α促进细胞的溶解与脱落,从而使自身获取营养,提高自身的存活率。而UPEC释放的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)与Toll样受体4(TLR4)结合,一边激活了NF-κB与MAPK通路,使细胞产生IL-6、IL-8、TNFα等炎性因子,通路上的中间产物也会激活Rho/ROCK通路,改变肌动蛋白的排列,同时,TLR4活化激活腺苷酸环化酶3产生AMP,从而诱导细胞将UPEC胞吐到伞细胞顶膜,UPEC却能通过某种未知的逃逸机制来躲避细胞的追捕,从而继续在细胞内繁殖形成IBCs,不断循环来破坏机体。在这个过程中,一方面是UPEC对细胞内部的侵蚀与破坏,另一方面,激活的RhoGTPases启动了Rho/ROCK信号通路,下游肌球蛋白轻链磷酸化水平升高,伞细胞之间TJ开放,尿液中的离子、分子、毒素等进入膀胱间质,进一步损害了膀胱的功能[30]。

阻断Ⅰ型菌毛FimH与伞细胞Ups的结合能让细胞避免细菌的入侵,不久前,出现了针对FimH的小分子甘露糖苷FimH拮抗剂,抑制其功能,阻止UPEC与膀胱上皮细胞的Ups结合,阻止细菌的内化,从而避免感染[31]。在体外实验中,有研究者通过抑制Rho/ROCK通路与激活cAMP通路,逆转了细胞在LPS诱导下TJ的受损状态,恢复了上皮的屏障功能[32]。同样,研究者在UPEC感染膀胱上皮细胞时,使用RhoGTPases的抑制剂,成功减轻了细菌的内化和侵袭[27]。在细菌耐药性越来越强的今天,通过靶向阻止细菌入侵或是通过上皮屏障选择性的阻断剂/激活剂去加强屏障功能,或许能为我们的临床治疗提供新的思路。

2.2间质性膀胱炎中上皮屏障的变化

间质性膀胱炎/膀胱疼痛综合征(IC/BPS)是一种没有明显原因,以尿频、尿急、膀胱区或骨盆区域感到压力或胀痛为主要症状的慢性膀胱疾病[33]。有研究观察到膀胱上皮屏障的糖胺聚糖层(GAGs)在IC/BPS患者中遭到破坏,通过膀胱内灌注的外源性GAGs成分可能有助于修复损伤。木聚硫钠是一种合成的多糖,旨在用来治疗GAGs的缺损,它的口服处方已经通过美国食品和药物管理局(FAD)的批准,可以用于IC/BPS患者的膀胱治疗。各种实验证明,木聚硫钠确实能改善IC/BPS患者的临床症状,但也伴随着明显的不良反应,如恶心、腹泻和脱发,对患者来说疗效好坏参半[34]。有一项随机开放的多中心实验显示,联合向膀胱内注射透明质酸和硫酸软骨素能是IC/BPS患者的症状和疼痛程度减轻,但疗效并不能长期保持[35]。而在不久前,也有研究显示,目前AUA(美国泌尿外科协会)对IC/BPS指南中审查的许多治疗方法仍然不具备良好的疗效[36]。

SanchezFreire等[37]对IC/BPS患者的膀胱组织进行了检测,发现对比正常人,这些膀胱组织中ZO-1、JAMs、Occludinn和Claudin1的mRNA表达水平下降,而Claudin2的mRNA水平却明显上升,这些结果表明,与IC/BPS相关的尿路上皮屏障发生了显著改变,TJ功能下降,通透性增加。这一发现也与之前使用抗增殖因子(APF,由IC患者膀胱上皮细胞产生的一种特异性糖蛋白,可诱导某些上皮细胞蛋白表达的改变,并对细胞生长产生抑制作用)处理体外培养的膀胱上皮细胞改变一致[38]。跨膜蛋白Claudin2具有负电荷表面,从而形成阳离子选择性的孔隙,研究证明,膀胱内高浓度的K+在Claudin2高表达的大鼠模型中会使膀胱变得敏感,加重了膀胱的疼痛和炎症,而低钾饮食的大鼠却没有出现疼痛和炎症[39],这说明了膀胱的炎症与疼痛是尿中K+穿过TJ到达膀胱间质的结果。TJ中Claudin2的过度表达是否是IC/BPS的原因,还是与潜在的缺陷有关,还有待确定。无论如何,过度表达的Claudin2可能会加剧与IC/BPS相关的症状。

2.3出血性膀胱炎与上皮屏障

出血性膀胱炎往往是因为肿瘤接受化疗或者放疗导致,膀胱出血和膀胱刺激征是最常见的临床表现[40,41]。环磷酰胺是引起出血性膀胱炎最常见的化疗药物,这种药物的代谢产物之一丙烯醛会进入尿液并在排出体外之前一直停留在膀胱中,与膀胱壁接触后,能直接对伞细胞的蛋白质与DNA链进行切割和断裂,并且耗尽细胞的能量来源,造成伞细胞的水肿、溃疡、坏死脱落,使得逼尿肌和血管直接暴露在尿液中,进一步造成刺激和出血[42]。放疗造成的出血性膀胱炎与化疗类似,高能量的辐射引起DNA链的断裂,从而导致了细胞的凋亡,并且放疗更容易对膀胱的肌层造成损伤,这使得血管变得更为脆弱,进一步减少了膀胱的血供和营养,最终引起疼痛和出血的症状[43]。

这些发现都指向了膀胱上皮屏障功能障碍足以诱发膀胱炎症和改变膀胱功能。膀胱炎的终末期往往是膀胱上皮的变薄或缺失以及膀胱壁的纤维化,此时患者的生活质量显著下降,手术治疗成了最好的方式。若能找到良好的替代GAGs且无不良反应的药物或是靶向调控TJ对离子和分子的选择渗透性,将上皮屏障功能尽可能完好地保留,这无疑能极大地提升患者的生活质量。

3、展望

在膀胱炎中,上皮屏障被破坏,导致各种病理状态,膀胱炎的临床治疗多局限于症状管理,但是却往往缺乏疗效或存在多种不足。对膀胱上皮细胞的深入研究,不仅能为我们认识膀胱的正常功能提供帮助,更重要的是能让我们对包括膀胱炎在内的多种膀胱疾病的发生机制的认识更进一步。新的替代药物治疗、新的选择性治疗靶点将在未来带给我们挑战与可能性,为临床治疗提供更丰富的选择。

尽管膀胱上皮黏膜屏障与膀胱疾病的研究取得了很大的进展,但仍有不少问题亟待解决:①TJ作为上皮黏膜屏障最为复杂的结构,它在膀胱疾病发展中的研究仍处于起步阶段,在膀胱疾病中的分子基础有待进一步研究;②使用破坏剂去除膀胱上皮伞细胞层后,下层的上皮细胞在几分钟内就开始表达TJ相关蛋白[44],这种机制还有待研究;③膀胱上皮屏障功能障碍,带来的后果往往是肌层受损甚至整个膀胱的功能丧失,而伞细胞能否对下层细胞进行信号传导至今尚无定论。这些都为我们以后的研究提供了方向。

参考文献：

[41]王伟,杨建军,杨关天,等.放射性膀胱炎的治疗进展[J].临床泌尿外科杂志,2019,34(6):489-492.

金诗尧,李守林.膀胱上皮黏膜屏障失调在膀胱炎发展中的作用[J].临床泌尿外科杂志,2021,36(02):152-156.