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应用双抗体夹心酶联免疫吸附法定量检测白喉类毒素抗原

  2021-12-03    179  上传者:管理员

摘要:目的对定量检测白喉类毒素(DT)抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)进行方法学验证并初步应用。方法以白喉抗毒素(DA)为包被抗体,大鼠抗DT抗体为检测抗体,辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠IgG抗体为酶标抗体检测DT抗原的含量,对双抗体夹心ELISA进行方法学验证。结果DT抗原含量在0~0.125Lf/mL范围内反应曲线线性关系良好(r=0.996),8次重复实验的r值为0.995~0.997。该方法与破伤风类毒素(TT)抗原、百日咳类毒素(PT)抗原、百日咳丝状血凝素(FHA)抗原和百日咳黏附素(PRN)抗原无明显交叉反应,特异性较好。精密度验证变异系数为1.445%~4.431%,准确度验证回收率为91.86%~105.47%,准确检测范围为0.001953125Lf/mL~0.125Lf/mL,定量限为0.001953125Lf/mL。分别采用双抗体夹心ELISA和絮状单位测定法测定6批类毒素原液中DT抗原的含量,结果显示2种检测方法呈高度相关(r=0.974),检测结果差异无统计学意义(P>0.05)。结论双抗体夹心ELISA灵敏度高,特异性强,能准确测定DT抗原的含量,可用于白喉疫苗生产工艺过程各阶段的抗原含量测定。

  • 关键词:
  • DT抗原
  • 双抗体夹心
  • 持久免疫力
  • 白喉类毒素
  • 酶联免疫吸附法
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白喉杆菌是严格寄生于人体的细菌,患者和带菌者是传染源,接种白喉疫苗可获得持久免疫力[1,2]。白喉疫苗的基础组分是白喉类毒素(DT)抗原[2,3],《中华人民共和国药典(三部)》采用絮状单位测定法检测DT抗原含量[4],但该检测方法白喉抗毒素(DA)和DT用量较多,结果判定的主观性较大,存在一定误差[5]。酶联免疫吸附法(ELISA)具有检测准确、敏感性高、特异性强和重复性好等优点,在DT抗原测定中已得到应用[5,6,7]。本研究采用DA为包被抗体,对定量检测DT抗原的双抗体夹心ELISA进行方法学验证,为DT抗原生产过程中的含量测定和联合疫苗中DT抗原吸附率评价提供依据。现报道如下。


1、材料与方法


1.1 仪器与试剂

405LSR洗板机(美国伯腾仪器有限公司);SpectraMax190酶标仪(美谷分子仪器有限公司);LegendMicro17台式离心机(ThermoFisher);恒温培养箱(上海福玛设备有限公司)。

硼酸盐缓冲液:称取四硼酸钠0.5g、硼酸4.5g和氯化钠8.5g,加水溶解并稀释至1000mL,pH值为7.0~7.2。碳酸盐缓冲液(pH=9.6):称取碳酸钠1.59g和碳酸氢钠2.93g,加水溶解至1000mL。磷酸盐吐温缓冲液:量取0.5mL聚山梨酯20,加磷酸盐缓冲液稀释至1000mL。封闭液:称取牛血清白蛋白10.0g,加磷酸盐缓冲液溶解并稀释至1000mL。底物缓冲液:称取醋酸钠0.68g和一水合柠檬酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)1.05g,加水溶解并稀释至1000mL,调pH值至3.6。底物液A:称取3,3',5,5'-四甲基联苯胺0.08g,加二甲基亚砜40mL溶解,加甲醇60mL,混匀,加底物缓冲液100mL,避光搅拌2h至完全溶解,室温静置4h后使用。底物液B:量取1.5%过氧化氢溶液3.2mL,加底物缓冲液稀释至1000mL。底物液:取底物液A和底物液B等体积混匀,临用前配制。终止液(2mol/L硫酸溶液):10mL98%浓硫酸加入60mL纯化水中,定容至100mL,室温保存。

包被抗体:DA絮状反应国家标准品(1000Lf/支,批号:0048,中国食品药品检定研究院),用硼酸盐缓冲液稀释至100Lf/mL备用。检测抗体:大鼠抗DT抗体由本实验室制备。酶标抗体:辣根过氧化物酶标记羊抗大鼠IgG抗体(Sigma公司)。DT抗原标准品[1100Lf/支,英国国家生物制品研究所(NIBSC),NIBSCcode02/176]用硼酸盐缓冲液稀释至2Lf/mL备用。DT抗原(批号:20200302、20200303-1、20200303-2、20200303-3、20200303-4、20200303-5)、破伤风类毒素(tetanustoxoid,TT)抗原、百日咳类毒素(pertussistoxoid,PT)抗原、百日咳丝状血凝素(filamantoushemagglutinin,FHA)抗原、百日咳黏附素(pertactin,PRN)抗原、吸附无细胞百白破(组分)联合疫苗[diphtheria,tetanusandacellularpertussis(component)combinedvaccine,adsorbed,DTaP]实验样品(批号:20180101、20180102、20180103、20200101、202004002、202005003、202005004)和氢氧化铝佐剂均由本实验室制备;DTaP市售品(批号:R3L38、U3D57、ROC941M)为赛诺菲-巴斯德公司产品。

1.2 双抗体夹心ELISA实验步骤

采用棋盘滴定法确定包被抗体及检测抗体的配伍关系。将DA(100Lf/mL)分别稀释至2、1、0.5和0.25Lf/mL,包被酶标板,大鼠抗DT抗体分别稀释2000倍、5000倍、10000倍和20000倍进行棋盘滴定,辣根过氧化物酶标记羊抗大鼠IgG抗体1∶10000稀释,检测准确稀释为0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125、0.00390625和0.001953125Lf/mL的DT抗原标准品。根据0.125Lf/mLDT抗原标准品的450nm吸光度(A450)值>1.0,0~0.125Lf/mLDT抗原标准品所建立的标准曲线相关系数(r)>0.990,且磷酸盐缓冲液作阴性对照的A450值<0.10,筛选最佳包被抗体和检测抗体浓度[5,8]。

将DT抗毒素(100Lf/mL)用碳酸盐缓冲液稀释至0.25Lf/mL,加入酶标板,每孔100mL,4℃包被过夜;磷酸盐吐温缓冲液洗板3次后每孔加入200mL封闭液,37℃孵育1h;磷酸盐吐温缓冲液洗板3次后加入待测样品及DT抗原标准品,同时设阴性对照孔(磷酸盐缓冲液),37℃孵育1h;磷酸盐吐温缓冲液洗板3次后加入大鼠抗DT抗体(10000倍稀释),每孔100mL,37℃孵育1h;磷酸盐吐温缓冲液洗板3次后加入辣根过氧化物酶标记羊抗大鼠IgG抗体(10000倍稀释),每孔100mL,37℃孵育1h;磷酸盐吐温缓冲液洗板3次后加入底物液,每孔100mL,进行显色反应15min;加入2mol/L硫酸溶液,每孔50mL,终止反应,10min内测定A450值[5,8]。

1.3 双抗体夹心ELISA的验证方法

1.3.1 线性关系的重复性

按照已建立的双抗体夹心ELISA的条件,建立絮状单位(Lf/mL)对应A450的log-log直线回归方程,确定最佳线性关系,重复试验8次,计算不同时间检测的r值,r值>0.990表示具有可重复性。

1.3.2 特异性

将10Lf/mL的DT抗原和TT抗原样品,以及100ng/mL的PT抗原、FHA抗原和PRN抗原作为待测样品,同时设立磷酸盐缓冲液作为阴性对照,评价双抗体夹心ELISA的特异性。检测样品A450值大于阴性对照的2.1倍,结果判定为阳性[7]。

1.3.3 定量限、准确度和精密度

采用双抗体夹心ELISA检测稀释为0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125、0.00390625、0.001953125、0.0009765625和0.00048828125Lf/mL的DT抗原标准品。每个浓度批内检测8次,批间检测3次,计算批内和批间检测的回收率、均值(x)、标准差(s)和变异系数(CV)。根据检测样品准确度和精密度均合适的最低稀释浓度确定方法的定量限;根据检测样品的准确度和精密度范围确定方法的准确检测范围。回收率和CV可接受标准:回收率为85%~115%、CV<10%。

1.4 双抗体夹心ELISA的应用

1.4.1 氢氧化铝佐剂对DT抗原吸附能力的测定

向氢氧化铝佐剂中加入DT抗原和0.85%氯化钠溶液,使铝离子的终浓度达到0.5mg/mL,DT抗原吸附后絮状单位分别达到25、75、250、500、1000、2000和3000Lf/mL。搅拌吸附1h后,以半径8.66cm,8000r/min离心5min,取上清测定DT抗原含量,计算吸附率。吸附率(%)=[(DT抗原加入量-上清中DT抗原量)/DT抗原加入量]×100%。

1.4.2 DT抗原吸附能力测定

选取6批DT抗原,经氢氧化铝佐剂吸附,使铝离子终浓度达0.5mg/mL,DT抗原吸附后絮状单位达到200Lf/mL。解吸附处理:每1mL中加入10mg柠檬酸钠,混匀,于37℃孵育24h进行解吸附[9]。解吸附后的待测样品和未经解吸附待测样品同时以半径8.66cm,8000r/min离心5min,取上清检测DT抗原含量。抗原吸附率(%)=[(解吸附DT抗原量-未解吸附DT抗原量)/解吸附DT抗原量]×100%。解吸附回收率(%)=(解吸附DT抗原量/DT抗原加入量)×100%。

1.4.3 2种检测方法DT抗原含量测定

应用已建立的双抗体夹心ELISA测定6批类毒素原液中DT抗原含量,与絮状单位测定法检测结果[4]进行比较。

1.4.4 DTaP联合疫苗中DT抗原含量及吸附率的测定

利用双抗体夹心ELISA对7批DTaP实验样品和3批DTaP市售成品的DT抗原含量及吸附率按照1.4.2步骤测定。

1.5 统计分析

采用Excel2019软件建立数据库,采用SPSS23.0软件统计分析。双抗体夹心ELISA与絮状单位测定法的相关性分析采用Pearson相关分析,判断标准:r的绝对值在0.500~0.800之间为显著相关(或中等程度相关),>0.800为高度相关[7]。双抗体夹心ELISA和絮状单位测定法测得的结果比较采用配对t检验。检验水准α=0.05。


2、结果


2.1 双抗体夹心ELISA的建立

当检测抗体10000倍稀释,包被抗体为0.25Lf/mL时,建立的双抗体夹心ELISA在DT抗原标准品浓度为0~0.125Lf/mL区间内呈现良好的线性关系,建立方程为y=1.0589x+1.5672,r2=0.992,r=0.996。

2.2 双抗体夹心ELISA的验证结果

8次试验的r值为0.995~0.997,均>0.990,具有可重复性。检测阴性对照A450值为0.095;TT抗原、PT抗原、FHA抗原和PRN抗原均呈阴性,A450值分别为0.098、0.099、0.110和0.099;DT抗原呈强阳性,A450值为2.877,特异性较好。DT抗原标准品加入量为0.001953125~0.125Lf/mL时,回收率为91.86%~105.47%,CV为1.445%~4.431%,准确度和精密度较好。双抗体夹心ELISA准确检测范围为0.001953125~0.125Lf/mL,定量限为0.001953125Lf/mL。见表1。

2.3 氢氧化铝佐剂吸附率检测结果

DT抗原在25~1000Lf/mL范围内吸附率均>90.00%,随着DT抗原含量的增加吸附率呈下降趋势,当DT抗原含量为2000Lf/mL和3000Lf/mL时,吸附率分别下降至86.32%和70.46%。

2.4 6批DT抗原吸附率检测结果

6批DT抗原氢氧化铝佐剂吸附后经解吸附,解吸附回收率为89.50%~109.21%,吸附率均>99.00%。见表2。

2.5 2种方法检测DT抗原含量比较

双抗体夹心ELISA和絮状单位测定法同时对6批DT抗原含量进行检测,结果显示:CV<10%,平均CV为3.738%,2种方法检测结果比值为0.95~1.11。2种方法测定结果呈高度相关(r=0.974),差异无统计学意义(t=0.312,P=0.531)。见表3。

2.6 联合疫苗中DT抗原吸附率检测结果

当DT抗原加入量为25Lf/mL,测得10批样品中DT抗原含量x为24.406Lf/mL,s为1.770,CV为7.253%。同时,测定DTaP成品中DT抗原吸附率均>99.90%,DT抗原与PT抗原、TT抗原、FHA抗原、PRN抗原相混合配制联合疫苗后,DT抗原未发生解离。见表4。


3、讨论


本研究利用DA为包被抗体,大鼠抗DT抗体为检测抗体,辣根过氧化物酶标记羊抗大鼠IgG抗体为酶标抗体,对定量检测DT抗原含量的双抗体夹心ELISA进行方法学验证,结果显示在0~0.125Lf/mL区间范围能够建立较理想的标准曲线,8次重复实验的r值均大于0.990,表明该法建立的标准曲线具有可重复性。特异性验证结果显示对高浓度的TT抗原、PT抗原、FHA抗原、PRN抗原和磷酸盐缓冲液的检测结果均为阴性,对10Lf/mL的DT抗原检测结果为强阳性,表明该法具有良好的特异性。准确度和精密度验证确定准确检测范围为0.001953125~0.125Lf/mL,定量限为0.001953125Lf/mL,表明该方法具有灵敏度高、检测准确的优点。对6批DT抗原分别采用双抗体夹心ELISA和絮状单位测定法检测结果显示2种方法呈高度相关。

参考文献[5,7],本实验探索了双抗体夹心ELISA在DT抗原质量控制过程的更多应用,通过检测氢氧化铝佐剂对DT抗原吸附能力发现,1mg铝离子可吸附2000LfDT抗原,而DTaP中对应的DT抗原含量为25Lf/mL,铝离子含量为0.5mg/mL,这一结果对制备高吸附率的多联多价疫苗意义重大。双抗体夹心ELISA在DT抗原吸附原液和DTaP中的应用结果表明该方法能够满足原液和DTaP中DT抗原吸附率的检测。解吸附实验结果表明该解吸附方法可将DT抗原从氢氧化铝佐剂上完全解吸附下来,解吸附回收率达85%以上,同时不对双抗体夹心ELISA测定DT抗原造成干扰,可用于吸附后原液和联合疫苗成品定量分析的前处理。

《中华人民共和国药典(三部)》中的絮状单位测定法只能对DT抗原从发酵至佐剂吸附前阶段的抗原含量进行检测,不适用于DT抗原吸附后的含量测定,难以完成对原液和DTaP成品的检测要求[3,4];而双抗体夹心ELISA能够对吸附工艺前后的抗原含量进行准确检测,可用于DT原液和DTaP成品吸附率的检测工作。

双抗体夹心ELISA优于絮状单位测定法,能够较准确、客观的检测DT抗原的含量,有利于DT抗原制备过程中的质量控制,对提高我国白喉疫苗的品质具有重要的实践意义。接下来可进一步研究双抗体夹心ELISA在以百白破为基础的联合疫苗相关检测中的适用性。


参考文献:

[1何思然,丁峥嵘.中国白喉的预防控制效果与免疫策略综述[J].中国疫苗和免疫,2017,23(6):711-715.

[2]王真行,邹力,陈敏.WHO关于白喉疫苗的意见书[J].国际生物制品学杂志,2018,41(2):97-100.

[3]张延龄,张晖.疫苗学[M].北京:科学出版社,2004:843-845.

[4]中华人民共和国国家药典委员会.中华人民共和国药典(三部)[S].北京:中国医药科技出版社,2020:581.

[5]张霖阳,杨冰,王珂,等.白喉类毒素酶联免疫检测法的建立及初步应用[M].微生物学免疫学进展,2016,44(2):45-49.

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文章来源:祝传顺,姚雷,周振发,洪禹,薛莹,朱卫华,杜琳.应用双抗体夹心酶联免疫吸附法定量检测白喉类毒素抗原[J].预防医学,2021,33(12):1286-1289.

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