近年来，脑出血(intracerebral hemorrhage, ICH)的患病率逐渐提高，而且是脑卒中致残率和病死率较高的类型之一，其重要病理基础是血脑屏障被破坏导致脑水肿形成失控，造成血肿周围持续水肿[1, 2]。近年来提出的神经保护策略未能提高ICH后患者的存活率及生活质量[3, 4]。因此，进一步研究ICH发生的分子机制并研发出安全有效的治疗方案对于ICH患者至关重要。近年来，越来越多的研究表明，MicroRNA (miRNA)在ICH诱导的脑损伤中起重要作用。miRNA是小的保守的非编码单链RNA，临床研究证实，ICH后血清或脑组织中多种miRNA的表达发生改变，这些miRNA对于ICH过程中炎症反应及神经元凋亡至关重要[5]。Nie等研究显示，下调miR-331-3p抑制TNF-α 和IL-6的表达，促进ICH小鼠神经功能的恢复[6]；Liu等研究显示，过表达miR-326可降低ICH小鼠神经细胞凋亡[7]。miR-16-5p作为一种miRNA，而关于miR-16-5p在ICH后的表达及对ICH大鼠炎症反应、氧化应激及神经细胞凋亡的影响尚未见报道。Cepparulo等研究显示，miR-16-5p在ICH大鼠血清中显著上调[8]，提示miR-16-5p可能参与ICH的进展。此外，Zhao等研究显示，下调miR-16-5p可减轻脊髓损伤诱导的神经元凋亡[9]。而miR-16-5p对ICH过程中神经元凋亡的影响尚不清楚。Hippo信号通路高度保守，其主要通过下游效应分子Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)调控细胞增殖、分化等行为，从而维持组织发育稳态[10]。研究显示，Hippo/YAP通路中YAP的活化对脑缺血/再灌注损伤大鼠的大脑具有神经保护作用[11]。而Wang等研究显示，miR-16-5p可通过调节YAP1/Hippo通路抑制胃癌进展[12]。因此我们猜想miR-16-5p可能通过调控Hippo/YAP通路抑制ICH大鼠神经元凋亡。为了验证这一猜想，本研究向大鼠右侧纹状体中注入胶原酶VII建立ICH模型，用miR-16-5p抑制剂干预，并同时给予Hippo通路激活剂或YAP抑制剂，检测大鼠神经元凋亡、脑组织病理、氧化应激和炎症情况，探究miR-16-5p对ICH大鼠神经元凋亡的影响以及其作用机制，旨在为ICH的临床治疗提供新的理论依据和可能的治疗靶点。

1、材料和方法

1.1动物

雄性Sprague Dawley (SD)大鼠(240~260 g，108只)购自贵州医科大学(实验动物中心)，动物许可证号为SYXK(贵)2021-0006，无菌手术在贵州医科大学(实验动物中心)进行，许可证号维SYXK(贵)2020-0004，该研究动物实验方案得到贵州医科大学动物伦理委员会的批准。实验严格遵循3R原则。

1.2主要试剂及仪器

miR-16-5p抑制剂(miR-16-5p antagomir)及其阴性对照antagomir阴性对照(antagomir NC)购自百奥迈科生物公司；Hippo通路激活剂葫芦素B (货号：BJ-7104)购自北京凯诗源生物公司；YAP抑制剂维替泊芬(货号：VTY80258)购自北京德航五洲公司；胶原酶VII (货号：C9722)购自浙江联硕生物科技有限公司；miRNA逆转录试剂盒(货号：AMRT-0020)购自亚太恒信生物科技(北京)有限公司；miRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒(货号：BTN131042)购自北京百奥莱博科技有限公司；大鼠超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)(货号：DS-496)、丙二醛(malonic dialdehyde, MDA)(货号：DS-362)试剂盒购自上海广锐生物公司；大鼠白细胞介素6 (interleukin-6, IL-6) ELISA试剂盒(货号：EK0412)购自上海中乔新舟生物公司；肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) ELISA试剂盒(货号：B7166)购自上海名劲生物公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(货号：BJ-10451)购自上海邦景公司；细胞核蛋白提取试剂盒(货号：BES-3115)购自上海博尔森生物公司；兔源抗Bcl2相关X蛋白(Bcl-2-associated X,Bax)(货号：ab32503)、Bim (货号：ab32158)、YAP1 (货号：ab56701)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)(货号：ab110724)、p-JNK (货号：ab207477)、Histone H3 (货号：ab1791)、GAPDH抗体(货号：ab181602)、HRP标记的山羊抗兔二抗(货号：ab6721)均购自美国Abcam公司。HistoCoreMULTICUT切片机购自德国徕卡仪器有限公司；DSX110型光学显微镜购自日本奥林巴斯公司。

1.3 ICH大鼠模型的构建及分组

随机选取90只大鼠进行ICH大鼠模型的构建，方法参照已发表文献[13]，步骤如下：用2%戊巴比妥钠腹腔麻醉大鼠，并将大鼠的头部固定于脑立体定位仪上，依据脑立体定位图谱，找到右侧纹状体(以前囟为原点，前囟前0.1 mm、前囟右侧3.5 mm钻孔，钻孔深度6.0 mm)，利用微量注射器向右侧纹状体中缓慢注入1μL含0.2 U胶原酶VII的生理盐水溶液，留针5 min后拔针。术后第2天进行神经功能评分，若评分为1~3分则视为造模成功[14]。在本研究中，90只大鼠均造模成功。另取18只大鼠作为正常对照(normalcontrol, NC)组，同样接受上述操作，不同的是向右侧纹状体中缓慢注入等体积的生理盐水。将造模成功的90只大鼠随机分为ICH模型(Model)组、antagomir NC组、miR-16-5p antagomir组、miR-16-5p antagomir +葫芦素B组、miR-16-5pantagomir +维替泊芬组，每组18只。antagomir NC组、miR-16-5p antagomir组、miR-16-5p antagomir +葫芦素B组、miR-16-5p antagomir +维替泊芬组。除Model组外，各组大鼠尾静脉注射10μg antagomir NC或miR-16-5p antagomir，同时腹腔注射等体积的生理盐水、葫芦素B (2 mg/kg体重[15])或维替泊芬(10mg/kg体重[16])；NC组和Model组大鼠尾静脉注射等体积的生理盐水，同时腹腔注射与药物处理大鼠等体积的生理盐水，每周给药1次，持续6周。整个处理过程中大鼠无死亡。

1.4神经功能评分

末次给药处理24 h后，对各组所有大鼠进行神经功能评分：无明显的神经功能缺损症状，0分；出现前肢伸展功能障碍等轻度神经系统障碍，1分；拉动动物尾巴时，动物呈单向旋转的状态，2分；动物表现出滚动运动的状态，3分；动物呈意识降低的状态，4分。

1.5 qRT-PCR检测

miR-16-5p表达 神经功能评分结束后，每组选取6只大鼠，麻醉并处死，取其血肿周围脑组织，匀浆后使用TRIzol试剂提取总RNA，利用miRNA逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA后，以cDNA为模板通过miRNA荧光定量RT-PCR检测试剂盒进行qRT-PCR。qRT-PCR反应条件：95 °C预变性30 s，95 °C变性5 s，65 °C退火40 s，72 °C延伸60 s，共40个循环，同时扩增每个样本的目的基因和内参基因，以U6为内参，通过2−ΔΔCt分析miR-16-5p相对表达量。引物由华大基因科技股份有限公司合成，引物序列：miR-16-5p：正向：5'-TAGCAGCACGTAAATATTGGCG-3'；反向：5'-TGCGTGTCGTGGAGTC-3'；U6：正向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；反向：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.6干-湿重法检测

脑组织含水量 神经功能评分结束后，每组另选取6只大鼠，麻醉并处死大鼠，分离全脑组织后称量脑组织鲜重并记录为W0，然后将脑组织置于100°C的干燥箱中烘24 h，称量并记录脑组织干重为W1，脑组织含水量(%) = (W0 − W1) / W0 × 100%

1.7 HE染色检测血肿周围脑组织病理变化

每组选取剩余的6只大鼠，处死大鼠并收集血肿周围脑组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后切成5 μm厚的切片，进行HE染色后用光学显微镜观察病理学变化。

1.8氧化应激及炎性因子水平的检测

取1.5中血肿周围脑组织匀浆，按照试剂盒说明书步骤检测脑组织匀浆中氧化应激指标MDA、SOD水平及炎症因子IL-6、TNF-α水平。

1.9 TUNEL法检测神经细胞凋亡

取1.7中石蜡包埋的5 µm切片，经脱蜡、抗原修复后，根据TUNEL试剂盒说明书，将载玻片与TUNEL试剂盒中提供的TdT和生物素-dUTP试剂的混合物孵育，然后用链霉亲和素-HRP和DAB底物染色。在400倍光学显微镜下计数TUNEL阳性细胞。

1.10 Western blot检测蛋白表达

取1.5中的血肿周围脑组织匀浆，用细胞核蛋白提取试剂盒提取核蛋白用于检测YAP1蛋白，用RIPA裂解液提取总蛋白，将蛋白质进行定量、电泳、转膜、封闭后，将膜与抗Bim (1:5 000)、Bax (1:3 000)、YAP1 (1:3 000)、p-JNK (1:2 000)、JNK (1:4 000)、Histone H3 (1:4 000)或GAPDH(1:1 000)抗体在4°C孵育过夜。TBST洗膜3次后，加入HRP标记的二抗(1:5 000)，孵育1 h。加入ECL试剂进行条带显色，然后以GAPDH为内参蛋白，使用ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值，计算目的蛋白的相对表达水平。

1.11统计分析

采用SPSS 22.0软件进行数据分析。数据以mean±SD表示，采用单因素方差分析进行多组之间的差异比较，组间两两比较采用Tukey检验，P < 0.05时认为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1各组大鼠神经功能评分比较

与NC组比较，Model组大鼠神经功能评分升高(P < 0.05)；与Model组、antagomir NC组比较，miR-16-5p antagomir组大鼠神经功能评分降低(P < 0.05)；与miR-16-5p antagomir组比较，miR-16-5p antagomir +葫芦素B组、miR-16-5pantagomir +维替泊芬组大鼠神经功能评分升高(P < 0.05)(表1)。

表1.各组大鼠神经功能评分比较

2.2各组大鼠血肿周围脑组织中miR-16-5p表达及脑组织含水量比较

与NC组比较，Model组大鼠血肿周围脑组织中miR-16-5p表达及脑组织含水量升高(P < 0.05)；与Model组、antagomir NC组比较，miR-16-5p antagomir组大鼠血肿周围脑组织中miR-16-5p表达及脑组织含水量降低(P < 0.05)；与miR-16-5p antagomir组比较，miR-16-5p antagomir +葫芦素B组、miR-16-5pantagomir +维替泊芬组大鼠脑组织含水量升高(P < 0.05)，miR-16-5p表达变化差异无统计学意义(图1)。

图1.各组大鼠血肿周围脑组织中miR-16-5p表达及脑组织含水量比较

2.3各组大鼠血肿周围脑组织HE染色结果

NC组大鼠脑组织神经细胞结构完整，排列整齐，染色均匀；Model组大鼠血肿周围脑组织神经细胞肿胀，排列紊乱，大多数细胞固缩，染色加深；与Model组、antagomir NC组比较，miR-16-5p antagomir组大鼠血肿周围脑组织病理损伤减轻；与miR-16-5p antagomir组比较，miR-16-5p antagomir +葫芦素B组、miR-16-5p antagomir +维替泊芬组大鼠血肿周围脑组织病理损伤严重，神经细胞肿胀、固缩，染色加深，排列不整齐(图2)。

图2.各组大鼠血肿周围脑组织病理变化

2.4各组大鼠血肿周围脑组织中氧化应激及炎性因子表达比较

与NC组比较，Model组大鼠血肿周围脑组织中MDA、IL-6、TNF-α 水平升高，SOD水平降低(P < 0.05)；与Model组、antagomir NC组比较，miR-16-5pantagomir组MDA、IL-6、TNF-α 水平降低，SOD水平升高(P < 0.05)；与miR-16-5pantagomir组比较，miR-16-5p antagomir +葫芦素B组、miR-16-5p antagomir +维替泊芬组MDA、IL-6、TNF-α 水平升高，SOD水平降低(P < 0.05)(表2)。

表2.各组大鼠血肿周围脑组织中SOD、MDA、IL-6、TNF-α 水平

2.5各组大鼠血肿周围脑组织神经细胞凋亡比较

与NC组比较，Model组神经细胞凋亡率升高(P < 0.05)；与Model组、antagomir NC组比较，miR-16-5p antagomir组神经细胞凋亡率降低(P < 0.05)；与miR-16-5p antagomir组比较，miR-16-5p antagomir +葫芦素B组、miR-16-5p antagomir +维替泊芬组神经细胞凋亡率升高(P < 0.05)(图3)。

图3.各组大鼠血肿周围脑组织神经细胞凋亡

2.6各组大鼠血肿周围脑组织中凋亡相关蛋白、Hippo/YAP通路相关蛋白及JNK蛋白表达比较

与NC组比较，Model组Bim、Bax、p-JNK蛋白表达升高，YAP1蛋白表达降低(P < 0.05)；与Model组、antagomir NC组比较，miR-16-5p antagomir组Bim、Bax、p-JNK蛋白表达降低，YAP1蛋白表达升高(P < 0.05)；与miR-16-5p antagomir组比较，miR-16-5p antagomir +葫芦素B组、miR-16-5p antagomir +维替泊芬组Bim、Bax、p-JNK蛋白表达升高，YAP1蛋白表达降低(P < 0.05)(图4和表3)。

4.各组大鼠血肿周围脑组织中Bim、Bax、YAP1、p-JNK蛋白表达

表3.各组大鼠血肿周围脑组织中Bim、Bax、YAP1、p-JNK蛋白表达水平

3、讨论

ICH是一种毁灭性的中风亚型，涉及脑内脑血管的异常破裂[17]。手术清除血肿是进行止血和缓解颅内压的首选方法[18]。然而，残留的血液残留物和血液分解产物仍会促进ICH后的继发性脑损伤，造成神经元损伤并延迟神经功能恢复[19]。因此，探究ICH发生的分子机制具有重要意义。越来越多的证据表明，ICH的发展涉及多种途径，例如炎症、氧化应激、兴奋性毒性和细胞凋亡，它们共同导致脑损伤[20, 21]。此外，活化的炎症因子，包括TNF-α 和IL-6，可诱导脑水肿和神经元凋亡[22]。而氧化应激是导致神经元损伤的一个突出因素，它通过调节细胞信号传导和抑制神经元活动导致神经功能障碍[23]。

本研究通过向大鼠右侧纹状体中注入胶原酶VII以构建ICH大鼠模型，结果显示，与NC组比较，Model组大鼠神经功能评分升高，提示ICH大鼠模型构建成功。此外，本研究结果显示，与NC组比较，Model组大鼠血肿周围脑组织病理损伤严重，脑组织含水量、MDA、IL-6、TNF-α 水平、神经细胞凋亡率及凋亡相关蛋白Bim、Bax表达升高，SOD水平降低，表明ICH大鼠存在炎症反应、氧化应激及神经细胞凋亡。研究ICH过程中炎症反应、氧化应激及神经细胞凋亡相应的分子机制，将有助于找到治疗ICH的有效新策略。本研究结果显示，miR-16-5p在Model组大鼠血肿周围脑组织中高表达，下调miR-16-5p可抑制ICH大鼠炎症反应、氧化应激及神经细胞凋亡，推测炎症反应、氧化应激加剧了神经细胞凋亡，最终引起ICH大鼠脑损伤，而下调miR-16-5p可逆转上述过程的发生，提示下调miR-16-5p可对ICH大鼠脑损伤发挥保护作用。miR-16-5p可能成为治疗ICH的潜在有效靶点。Hippo信号传导的核心由激酶级联组成：上游磷酸化激酶哺乳动物不育系20样激酶1/2 (mammalian sterile 20-like kinase 1/2, MST1/2)促进大肿瘤抑制因子1/2(large tumor suppresser homolog 2, LATS1/2)磷酸化和活化，随后该磷酸化通路进而磷酸化YAP，并促进YAP在胞质中的保留和降解。但是，如果YAP没有被磷酸化，它会转移到细胞核中，与转录因子相互作用以调节参与细胞生长、存活和代谢的基因的表达[24]。研究显示，抑制Hippo信号通路可促进YAP的核易位，从而减轻小鼠ICH后的脑损伤[25]；Zhang等研究显示，抑制Hippo信号通路可抑制ICH大鼠的神经细胞凋亡和炎症反应[26]。

本研究结果显示，与NC组比较，Model组核YAP1蛋白表达降低；与Model组比较，miR-16-5p antagomir组核YAP1蛋白表达升高，推测下调miR-16-5p对ICH大鼠脑损伤的保护作用可能与Hippo/YAP通路有关，为了验证该猜想，本研究将给予miR-16-5p抑制剂的ICH大鼠的同时，用Hippo通路激活剂葫芦素B或YAP抑制剂维替泊芬进行干预，结果显示，葫芦素B和维替泊芬均减弱下调miR-16-5p对ICH大鼠氧化应激、炎症反应、神经细胞凋亡的抑制作用，且二者减弱效果之间无显著差异，提示下调miR-16-5p对ICH大鼠脑损伤的保护作用可能与抑制Hippo通路、激活YAP有关。此外，本研究结果还提示，下调miR-16-5p可能通过调控Hippo/YAP通路抑制ICH大鼠脑组织中p-JNK蛋白的表达。Li等研究显示，YAP对JNK信号通路具有调控作用[27]。根据以上结果，我们推测下调miR-16-5p对ICH大鼠脑损伤的保护作用除了与Hippo/YAP通路有关外，可能与JNK信号传导也有关。进一步具体机制有待后续实验进一步验证。综上所述，下调miR-16-5p对ICH大鼠脑损伤的保护作用可能与抑制Hippo通路、激活YAP有关。本研究为脑出血的临床治疗提供了潜在的新策略和方法。

文章来源:赵胜,杨华,吴钊,等.miR-16-5p通过调控Hippo/YAP通路对脑出血大鼠神经元凋亡的影响[J].中国免疫学杂志,2025,41(02):336-341+350.