动脉粥样硬化（AS）是一个以血管内皮细胞损伤为基础、以脂质浸润和血管壁炎症为特征的病理过程，是心脑血管疾病的病理基础，严重威胁人类健康[1,2]。炎症反应参与了AS发生发展的全过程，巨噬细胞是斑块炎症反应的关键因素，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）刺激巨噬细胞加速泡沫细胞的形成，触发炎症通路的激活，如NOD样受体3(NLRP3）炎症小体。NLRP3炎症小体能激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1），诱导前体（pro）-白细胞介素（IL)-1β成为成熟的IL-1β，在此过程产生的蛋白和炎性因子能影响AS的进程[3,4]。

地奥心血康（DXXK）的成分是从薯蓣科植物黄山药、穿龙薯蓣根茎中提取的甾体总皂苷，具有活血化瘀，行气止痛，扩张冠脉血管，改善心肌缺血等功效，用于预防和治疗冠心病、心绞痛等疾病[5,6]。课题组前期研究表明DXXK具有抑制肿瘤坏死因子-α（TNF-α），IL-1β表达，抗AS作用[7]。由于NLRP3炎症小体主要负责对前体IL-1β的剪切及激活，使其成为有活性的IL-1β，因此DXXK可能通过抑制NLRP3炎症小体的组成、装配和活化，从而抑制炎性因子IL-1β等的表达发挥抗AS作用[8,9]。本文采用氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞建立细胞模型，高脂饲料加维生素D2(VD2）复制AS大鼠模型，从体内和体外两方面探讨DXXK通过调节NLRP3炎症小体发挥抗AS的作用机制。

1、材料

1.1动物与细胞株

60只SD雄性大鼠，7周龄，体质量（200±20)g，购于山东省实验动物中心，动物合格证号SCXK（鲁）2019-0003，所有动物实验部分均经过安徽中医药大学动物伦理委员会审批。大鼠在12h明暗交替的环境中饲养，温度（22±2）℃，相对湿度50%±10%。小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7购自中国科学研究院上海细胞库。

1.2药物与试剂

地奥心血康胶囊和原料药（成都地奥制药集团有限公司，批号1901045）；阿托伐他汀钙片（辉瑞制药有限公司，批号CG7097）；阿托伐他汀钙对照品（上海源叶生物技术有限公司，批号B09A7R12611);VD2注射液（江西赣南海欣药业股份有限公司，批号19122801);ox-LDL（广州奕元生物技术有限公司，批号YB-002);MCC950（美国AbMole公司，批号M8083）；胎牛血清（FBS）进口血清（美国Gbico公司，批号42Q6291K);DMEM培养基（美国SparkJade公司，批号ATNPW）；苏木素，伊红，天狼星红染色试剂，小鼠TNF-α，IL-1βELISA检测试剂盒，NLRP3抗体，凋亡相关斑点样蛋白（ASC）抗体，Caspase-1抗体，β-肌动蛋白（β-actin）抗体，辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗兔免疫球蛋白（Ig)G,HRP标记山羊抗小鼠IgG,HRP标记山羊抗大鼠IgG（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号分别为CR2002143,ZH201412,CR2005052,GM1150,GM1152,LS203752,LS203745,LS203831,GB12001,GB23303,GB23301,GB23302）；大鼠TNF-α，IL-1β酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测试剂盒（武汉博士德生物公司，批号分别为EK0526,EK0393);BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术公司，批号102517180413);RNA提取液，Servicebio®RTFirstStrandcDNASynthesisKit,2×SYBRGreen实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-timePCR)MasterMix(LowROX）（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号分别为G3013,G3330,G3321）。高脂饲料配方[10]:0.15%胆固醇，21%猪油，78.85%基础饲料。

1.3仪器

Foram370型细胞培养箱（美国Thermo公司）；SW-CJ-IFD型超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；URIT-8200型全自动生化分析仪（广西桂林优利特集团有限公司）；NOVA型超薄切片机（瑞典LKB公司）；164-5050型基础电源电泳仪，Real-timePCR仪（美国Bio-Rad公司）；LAS4000GE型凝胶成像系统（美国GE公司）；RT-6000型酶标分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；BX51型倒置显微镜，BX43型正置荧光显微镜（日本Olympus公司）。

2、方法

2.1细胞培养

RAW264.7细胞培养于含10%胎牛血清DMEM培养液中，置于37℃，5%CO2培养箱中。当单层细胞融合度达80%以上时用0.25%胰蛋白酶进行消化，每周传代培养2～3次。

2.2细胞分组及干预

取对数生长期RAW264.7细胞接种于6孔板中，分为正常组，模型组，MCC950组（12mg·L-1),DXXK组（10mg·L-1）及MCC950+DXXK组，每组设3个平行组，于37℃，5%CO2培养箱培养24h后，除正常组外，其余各组加入80mg·L-1ox-LDL刺激，培养24h，药物剂量参考文献方法制定[11,12];MCC950组和MCC950+DXXK组加入MCC950干预，DXXK组及MCC950+DXXK组加入DXXK共作用24h；细胞转移至无菌离心管内，1000r·min-1离心5min（离心半径8cm，下同）后收集细胞上清液待测，细胞沉淀用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，弃去PBS后收集细胞沉淀待测。

2.3动物分组、造模与给药

60只7周龄雄性SD大鼠，适应性饲养1周，随机分成正常组、模型组、阿托伐他汀钙组（2mg·kg-1),DXXK高、中、低（100,30,10mg·kg-1）剂量组，每组10只，药物剂量、随机分组及造模方法参考课题组前期研究[7]，正常组大鼠饲喂普通饲料，其他组大鼠饲喂高脂饲料+VD2腹腔注射，实验开始前腹腔注射VD26.0×105U·kg-1，实验第3,6,9周分别注射VD21.0×105U·kg-1。第10周开始灌胃给药，连续8周。末次给药后，大鼠禁食不禁水12h,20%乌拉坦腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，随后取出各组大鼠腹主动脉至心脏部位的主动脉，以及心脏，分离出腹主动脉和靠近心脏的主动脉窦部于4%多聚甲醛中固定，后续用于病理形态学检测[13,14]，胸主动脉保存于-80℃冰箱中，用于基因和蛋白检测。血液样本在室温下静置1h,3000r·min-1离心15min，分离血清，保存于-20℃冰箱中以待检测。

2.4大鼠血脂检测

用全自动生化分析仪检测血清中总胆固醇（TC），甘油三酯（TG），低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量；计算AS指数[15](AI);AI=(TC-HDL-C）/HDL-C。

2.5ELISA检测血清与细胞TNF-α和IL-1β的水平

按照ELISA试剂盒说明书，分别设计标准孔及对照孔，根据ELISA试剂盒说明书步骤进行，在450nm波长下分别检测血清与细胞TNF-α和IL-1β的吸光度A，由标准曲线算出结果。

2.6Real-timePCR检测NLRP3,ASC及Caspase-1mRNA表达

按照试剂盒说明书采用TRIzol法分别提取胸主动脉匀浆和细胞沉淀总RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度。胸主动脉匀浆逆转录条件为65℃，5min;42℃，60min;70℃，5min；引物序列由武汉赛维尔生物科技有限公司合成，扩增反应条件为95℃预变性10min,95℃变性15s,60℃退火60s,72℃延伸30s,40个循环，每个样品重复3次。细胞沉淀逆转录条件为25℃，10min;50℃，30min;85℃，5min；引物序列由南京奥青生物技术有限公司合成，扩增反应条件为95℃预变性1min,95℃变性15s,63℃退火25s,72℃延伸30s,40个循环，每个样品重复3次。Real-timePCR检测NLRP3,ASC及Caspase-1mRNA表达，以2-ΔΔCt相对定量法进行统计分析[16]。PCR引物序列见表1。

2.7蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测NLRP3,ASC,Caspase-1蛋白的表达

胸主动脉研磨成匀浆，细胞沉淀经PBS洗涤后收集，分别提取胸主动脉和细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。制备10%SDS-PAGE胶，每孔加入等量蛋白样品进行电泳；转移蛋白至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭2h,TBST洗膜后与一抗（1∶1000)4℃孵育过夜；洗膜后加入相应二抗（1∶5000）室温下摇床孵育1.5h；洗膜后于暗室滴加ECL化学发光试剂显影[17]。使用ImageJ软件，对蛋白条带进行灰度值计算，与内参比较，分析相对蛋白表达量。

2.8苏木素-伊红（HE）染色观察腹主动脉及主动脉窦的组织结构改变

取出腹主动脉及主动脉窦，置于4%多聚甲醛溶液中固定，经过脱水、透明、常规石蜡包埋、切片，腹主动脉经HE染色，主动脉窦进行天狼星红染色，于显微镜下观察大鼠腹主动脉病理变化及主动脉窦胶原纤维变化。

2.9统计学处理

采用SPSS23.0进行统计学分析，计量资料均采用表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著性差异法（LSD）检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

3、结果

3.1对RAW264.7细胞TNF-α，IL-1β含量及NLRP3,ASC,Caspase-1mRNA和蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组细胞TNF-α，IL-1β含量及NLRP3,ASC,Caspase-1mRNA和蛋白表达均显著升高（P<0.01）；经MCC950和DXXK干预后，与模型组比较，各药物干预组TNF-α，IL-1β含量及NLRP3,ASC,Caspase-1mRNA和蛋白表达显著降低（P<0.01），差异有显著统计学意义；且MCC950+DXXK组效果优于DXXK组和MCC950组。见表2～4，图1。

3.2对AS大鼠血脂及AI的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清TC,TG,LDL-C的含量及AI显著升高，HDL-C含量显著下降（P<0.01）；与模型组比较，阿托伐他汀组和DXXK各剂量组血清TC,TG,LDL-C含量及AI明显降低（P<0.05,P<0.01),HDL-C含量明显升高（P<0.05,P<0.01）。见表5。

3.3对AS大鼠血清TNF-α，IL-1β含量及胸主动脉NLRP3,ASC,Caspase-1mRNA和蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清TNF-α，IL-1β含量及胸主动脉NLRP3,ASC,Caspase-1mRNA和蛋白表达水平均显著升高（P<0.01）；与模型组比较，DXXK各剂量组和阿伐他汀组大鼠血清TNF-α，IL-1β含量及胸主动脉NLRP3,ASC,Caspase-1mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.05,P<0.01）。见表6～8，图2。

3.4对AS大鼠腹主动脉病理变化及主动脉窦胶原纤维的影响

HE染色光镜下，正常组大鼠腹主动脉壁结构完整，内膜光滑无中断，纹理清晰，薄厚均匀，未见明显异常；模型组大鼠腹主动脉壁粗糙，内膜明显增厚，内皮断损不连续，平滑肌细胞增生，排列紊乱，内见泡沫细胞；与模型组比较，DXXK各剂量组和阿托伐他汀组大鼠主动脉病变程度明显减轻。见图3。天狼星红染色光镜下，正常组大鼠主动脉窦部未见胶原纤维增生；模型组大鼠主动脉窦部红色部分为胶原纤维，其显著增加；与模型组比较，DXXK各剂量组和阿托伐他汀组大鼠主动脉窦部胶原纤维减少。见图4。

4、讨论

高脂饲料喂养建立AS大鼠模型，可使模型大鼠产生脂质代谢紊乱，导致血浆中的脂质在主动脉内膜下沉积并伴随内膜增厚，炎性浸润等。联合腹腔注射VD2可使血钙升高，加速AS的形成[18]。在AS病变中，主动脉根部、主动脉弓的小弯曲处、主动脉的主要分支以及肺动脉和颈动脉容易出现病变，主动脉窦是位于主动脉弓内的压力感受器，研究证实在AS发病过程中，主动脉窦胶原纤维会增加[13,14]，为保证组间检测相同指标所用动脉部位相同，因此选择主动脉和主动脉窦进行病理观察。在本实验中，造模后大鼠腹主动脉病理切片显示腹主动脉壁粗糙，内膜明显增厚，平滑肌细胞增生，排列紊乱，内见泡沫细胞聚集，表明AS模型建立成功。阿托伐他汀通过抑制HMG-CoA还原酶发挥调脂作用，且具有抑制NLRP3炎症小体减轻炎症反应发挥抗AS的作用，DXXK也具有调脂和抗炎作用。在DXXK和阿托伐他汀药物干预后，腹主动脉病变得到不同程度改善，主动脉窦胶原纤维也不同程度减少，表示阿托伐他汀和DXXK均可减轻AS大鼠腹主动脉病变，发挥抗AS作用。

AS是一个以血管内皮细胞损伤为基础、以脂质浸润和血管壁炎症为特征的病理过程[1]。当促炎单核细胞被募集到动脉的内膜层时，单核细胞分化为巨噬细胞；当发生脂质代谢障碍后，体内TC,TG和LDL-C含量会升高，进而产生的ox-LDL促进巨噬细胞转化为泡沫细胞，释放的促炎细胞因子导致一系列炎症反应，使脂质沉积在血管壁上形成AS斑块，而高密度脂蛋白（HDL）则能对抗这一病理过程，抑制泡沫细胞产生炎症因子[19,20,21]。NLRP3炎症小体参与AS，是AS中炎症和脂质代谢之间的联系，NLRP3炎症小体由NLRP3，凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1前体（pro-Caspase-1）组成[22,23]。NLRP3炎症小体被AS病变中丰富存在的各种内源性危险信号激活，如ox-LDL和胆固醇晶体与动脉血管内巨噬细胞膜上的NLRs和TLRs受体相连，导致巨噬细胞的蓄积并形成泡沫细胞，大量泡沫细胞沉积在内膜上形成AS斑块；TLRs受体被刺激会激活NF-κB以增加TNF-α，IL-6,pro-IL-1β，pro-IL-18的表达；NLRs受体被刺激使NLRP3炎症小体完成组装，使pro-Caspase-1水解成活性的Caspase-1，活化后的Caspase-1剪切proIL-1β，pro-IL-18使其成为成熟的IL-1β，IL-18，从而增强炎症反应，推动AS的发生和发展[24,25,26]。本研究特色之一是通过体内和体外实验同时探讨DXXK抗AS的作用是否与调节NLRP3炎症小体有关。采用ox-LDL刺激小鼠RAW264.7细胞建立细胞模型，用DXXK或（和）NLRP3炎症小体特异性抑制剂MCC950干预。ox-LDL刺激RAW264.7细胞，使其生成泡沫细胞进而释放炎症因子，是目前常用的复制AS细胞模型的方法。结果显示RAW264.7细胞经ox-LDL刺激后，NLRP3炎症小体被激活，IL-1β，TNF-α表达增加；用DXXK或MCC950干预，均发现NLRP3炎症小体活性被抑制，有效地降低RAW264.7细胞中NLRP3,ASC及Caspase-1mRNA和蛋白的表达，减少细胞上清液中炎性因子IL-1β，TNF-α的含量，并且DXXK与MCC950合用效果呈现协同作用，表明DXXK可以靶向作用于NLRP3炎症小体，抑制其活性，降低炎性因子的表达，从而减轻炎症反应。体内实验结果显示，DXXK显著降低AS大鼠血清中TC,TG,LDL-C，升高HDL-C，且AI显著降低，AI是一个衡量动脉硬化程度的指标，数值越高则代表硬化的程度越严重；这些结果表明DXXK具有调节AS大鼠的血脂异常以及改善腹主动脉病变的功能。对AS大鼠血清中炎性因子含量和胸主动脉中的NLRP3炎症小体相关基因和蛋白进行了检测，发现DXXK可有效的抑制NLRP3炎症小体活性，降低炎性因子的表达，减轻AS大鼠炎症反应，发挥抗AS的作用。

综上所述，本研究表明DXXK可以调节AS大鼠的血脂，降低AI，改善腹主动脉病变，抑制AS大鼠胸主动脉和ox-LDL刺激的RAW264.7细胞中NLRP3炎症小体的活性，下调IL-1β和TNF-α的表达，减轻炎症反应，发挥明显抗AS作用，抑制NLRP3炎症小体可能是其作用机制之一。

文章来源：何祥,李国莺,汪丹丹,陈光亮.基于NLRP3炎症小体探讨地奥心血康抗动脉粥样硬化作用机制[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(20):55-62