慢性萎缩性胃炎（CAG）是以胃黏膜上皮和腺体萎缩、黏膜变薄、黏膜肌层增厚及伴有肠腺化生、不典型增生为特征的慢性疾病。该病易发生肠上皮化生（IM）和不典型增生（ATP），与胃癌的发生有密切关系，癌变率高达9%～10%。因此如何治疗CAG，逆转IM和ATP，防止癌症的发生是临床医家关注的重点。

氧化应激（OS）是现在的热门研究领域之一，是一种与炎症或环境应激有关的细胞应激。生理情况下，机体处于氧化-抗氧化的平衡状态，生命体得以正常生长。当这种平衡被打破，人体即会患病。氧化应激反应能够增强多种恶性肿瘤发生和发展的概率[1]。核因子E2相关因子2(Nrf2）可以调节细胞内大量具有抵抗自由基作用的物质的表达。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1）-核因子E2相关因子2(Nrf2）/抗氧化反应元件（ARE）信号通路是用于调节机体氧化炎症状态的重要通路之一，也是近几年研究的热门领域。当发生氧化应激时，Nrf2被激活，从而激活Keap1/Nrf2/ARE信号通路，调控下游靶基因醌氧化还原酶-1(NQO1），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等的转录和表达，保护细胞和组织免受氧化应激的损害[2]。且有研究发现CAG患者血清及胃黏膜氧自由基增多，抗氧化酶活性降低。说明CAG的发生与氧化应激相关，调节机体氧化应激可以达到治疗CAG的目的[3,4,5,6]。

中医无CAG病名，按其症状以“胃脘胀满不适”归属于“胃痞证”之范畴。半夏泻心汤出自《伤寒杂病论》，是治疗心下痞满的经典方，具有和胃降逆，散结消痞之功效。长期以来，众多医家运用半夏泻心汤治疗CAG取得了满意疗效[7,8,9]。本人在跟随王彦刚教授出诊期间，发现其善用半夏泻心汤加减治疗CAG，效果显著，且前期研究发现CAG患者血清中GSH-Px，超氧化物歧化酶（SOD）减少[7]。但其是否通过影响Keap1/Nrf2/ARE信号通路，改善氧化应激而发挥治疗CAG的目的，目前尚不明确，且国内现在关于半夏泻心汤通过改善氧化应激而治疗CAG的研究尚不多见。

故实验以CAG大鼠模型为研究对象，对Keap1/Nrf2/ARE信号通路中的主控调节因子Nrf2及其调控的下游靶蛋白NQO1，谷胱甘肽-S-转移酶（GST）的表达进行研究，旨在探讨CAG与Keap1/Nrf2/ARE信号通路的相关性及半夏泻心汤治疗CAG的作用机制。

1、材料

1.1动物

70只体质量160～180g，月龄为6～8周的健康雄性清洁级SD大鼠，购自河北医科大学动物实验中心，合格证号SCXK（冀）2018-1-003。本研究经河北中医学院伦理委员会审批，审批号为DWLL2018048。

1.2药物

半夏泻心汤组成：半夏12g，黄芩9g,干姜9g，黄连3g，人参9g，炙甘草9g，大枣12枚。以上药物均购自河北省中医院药房，并由药剂科主任关胜江教授鉴定符合2020年版《中华人民共和国药典》要求。后浓缩配成含生药2.8,1.4,0.7g·mL-1的药液，于2～5℃冰箱储存备用。1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍（MNNG，东京化成工业株式会社，批号NH8JH-LE）；盐酸雷尼替丁胶囊（石家庄四药有限公司，批号LN16050402）；维酶素胶囊（韦司太）（德州博成制药有限公司，批号W20151003）；无水乙醇注射液[罗辅医药（上海）有限公司，规格500mL]。

1.3试剂

TRIzol（美国Invitrogen公司，批号15596026）；反转录试剂盒（美国Fementas，批号K1622）；荧光定量试剂盒（北京华越洋生物科技有限公司，批号WD3122);Nrf2多克隆抗体（美国Abbkine公司，货号ABP0106);NQO1多克隆抗体（上海邦景实业有限公司，货号P114195);GST多克隆抗体（亚诺法生技股份有限公司，货号PAB13748）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，货号YT165）；二抗（上海儒安生物科技有限公司，批号R210-100）；内参抗体（武汉金开瑞生物工程有限公司，货号GC-MA000091M0m）。

1.4仪器

BHM36Humal型半自动生化分析仪（德国豪迈公司），8580090(10148）型高速冷冻离心机（美国Sigma公司），TDL-5-A型离心机（上海安亭科学仪器厂），LAUDA-C3型循环恒温水浴箱（天津泰克仪器有限公司），RM2125RT型石蜡切片机（徕卡上海分公司），756-PC型紫外-可见分光光度仪（上海谱振生物），DL-UV312型紫外透射仪（北京鼎国昌盛生物技术有限公司），CKX41-A32PH型全能显微镜（日本Olympus公司），MDF-382E型超低温保存箱（日本Sanyo公司），PE9600型PCR扩增仪（美国PE公司），DYCZ-24DH型电泳仪及DYCP-31C型电泳槽（北京六一公司），INFINITY3026型凝胶图像分析系统（法国VL公司）。

2、方法

2.1药物制备

半夏泻心汤的制备：半夏泻心汤按照2.2项中的用量投料，置于蒸馏水中浸泡30min（水面高出药物3cm），武火煮沸后改文火，半夏先煎30～60min至口尝无麻辣感，然后将其余药物放入煎锅中煎煮30min，倒出药液。再加入适量蒸馏水（水面与药物持平），武火煮沸后文火慢煎30min。将2次药液混合，用旋转蒸发仪将水煎液减压浓缩至2.8g·mL-1母液，使用200目尼龙网筛过滤，然后置于2～5℃冰箱冰箱储存备用，用时稀释。MNNG使用前加水制成质量浓度为80mg·L-1的溶液。雷尼替丁胶囊用0.85%的氯化钠溶解。乙醇加蒸馏水制成体积分数为45%的乙醇溶液。

2.2动物模型制备

将SD大鼠饲养于18～22℃明暗各12h的清洁级动物实验室内，适应性喂养1周后随机抽取12只大鼠作为正常组，剩余58只大鼠作为模型组。采用联合造模法[10]即大鼠自由饮用MNNG的同时第1～8周，灌胃45%乙醇，10mL·kg-1每周1次；第1～20周，用雷尼替丁0.03g·kg-1灌胃，建立CAG大鼠模型。造模过程中死亡6只，存活52只。造模20周后，随机抽取正常组和模型组大鼠各2只，处死后解剖取其胃组织做病理检查，直至大鼠胃黏膜层变薄，上皮细胞变性、坏死甚至脱落，固有腺体减少，排列紊乱提示造模成功。

2.3分组及给药方法

确认造模成功后，将大鼠按随机数字表法分为6组，分别为正常组、模型组、维酶素组（60mg·kg-1）及半夏泻心汤高、中、低剂量组（280,140,70mg·kg-1）剂量组，分别相当于半夏泻心汤生药量28,14,7g·kg-1，为成人临床剂量的20,10,5倍。正常组及模型组大鼠给予等体积的蒸馏水，各治疗组给予相应容积的药物灌胃。每天按照10mL·kg-1灌胃1次，连续灌胃12周。12周后，各组大鼠禁食水48h,10%水合氯醛3.5kg·mL-1腹腔注射麻醉后取材。

2.4HE染色观察胃黏膜组织病理学变化

取材后经甲醛固定，乙醇脱水，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，HE染色，中性树胶封片。在光学显微镜下（200×）观察胃黏膜组织病理学改变，参照慢性胃炎病理诊断标准和新悉尼系统的直观评分法[11]将炎症、萎缩和肠上皮化生等组织学变化分为无、轻、中、重度4个级别，分别计0,1,2,3分。

2.5蛋白免疫印迹法（Westernblot）检测相关蛋白表达

提取胃组织总蛋白，用考马斯亮蓝检测蛋白浓度，变性，BCA法进行蛋白定量，根据蛋白定量结果，上样至凝胶孔中，进行聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳，分离蛋白，转膜，室温振荡封闭膜2h，浸入一抗（1∶1000）工作液中，4℃反应过夜，TBST洗膜3次，每次10min，然后加入羊抗兔二抗（1∶5000）工作液中室温孵育1h,TBST洗膜3次，每次10min。ECL试剂盒两种液体混合后均匀铺在PVDF膜表面，室温作用4min，检测蛋白条带，曝光，DAB显色后，用TanonGis软件扫描各条带自动生成灰度值，目的蛋白表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

2.6实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-timePCR）检测相关mRNA表达

用TRIzol提取胃组织总RNA。取RNA5μL用1%琼脂糖凝胶进行电泳，以检测RNA的完整性。用TIANScriptRTkit进行反转录，实验操作按产品说明书进行，取总RNA1µg，加入反应体系的第一部分[包括Oligo(dT)50μL,SuperPuredNTP，无核酸酶双蒸水]管中，混匀，70℃加热5min，迅速在冰上冷却2min，简短离心收集反应液后加入50μL反应体系的第二部分（包括混合物，5×First-StrandBuffer,RNasin,TIANScripM-MLV），轻轻吸打混匀，25℃温浴10min,42℃温浴50min,95℃加热5min。用无核酸酶双蒸水将反应体系稀释到50μL,-20℃保存备用。PCR扩增条件为95℃变性15min，退火56℃，95℃延伸10s,40个循环，58℃，30s40个循环，72℃，30s40个循环。根据Real-timePCR原始检测结果，按照2-ΔΔCt相对定量计算公式，计算出各样品的目的基因相对定量结果，即其他各个样品相对于对照样品目的基因mRNA转录水平的差异。引物序列由Primer3.0软件设计，各引物序列见表1。

2.7统计分析方法

采用IBMSPSS23.0分析软件对数据进行处理，计量资料采用表达，方差齐选用最小显著性差异法（LSD），方差不齐选用非参数检验，计数资料采用秩和检验，以P<0.05为差异有统计学意义，病理学积分采用频率进行统计分析。

3、结果

3.1对CAG大鼠胃黏膜病理形态的影响

正常组胃黏膜厚度正常，上皮细胞完整，腺体排列整齐且数量适中，无充血、水肿及炎性细胞浸润。模型组胃黏膜变薄，腺体减少且排列紊乱，多量腺体肠化，部分腺体增生性囊状扩张，黏膜及黏膜下层炎性细胞浸润；各给药组中维酶素、半夏泻心汤中、高剂量组黏膜增厚，腺体排列整齐，炎性细胞浸润数量减少，萎缩、肠化病理改变等减轻，且以半夏泻心汤高剂量组病理改善最明显，半夏泻心汤低剂量组胃黏膜未见明显改善。见表2，图1。

3.2对CAG大鼠胃黏膜组织Nrf2,NQO1,GST蛋白表达水平的影响

与正常组比较，模型组Nrf2,NQO1,GST蛋白表达水平明显升高（P<0.05）；与模型组比较，除半夏泻心汤低剂量组外，半夏泻心汤中、高剂量组及维酶素组均能明显降低CAG大鼠胃黏膜中Nrf2,NQO1,GST蛋白的表达水平（P<0.05），其中半夏泻心汤高、中剂量组在调节Nrf2,NQO1,GST蛋白表达水平方面差异无明显统计学意义，半夏泻心汤高、中剂量组在调节降低Nrf2,GST蛋白表达水平方面优于维酶素组，差异有统计学意义（P<0.05），但在调节NQO1蛋白表达水平方面，半夏泻心汤高、中剂量组与维酶素组间差异无统计学意义。见图2，表3。

3.3对CAG大鼠胃黏膜组织Nrf2,NQO1,GSTmRNA表达水平的影响

与正常组比较，模型组Nrf2,NQO1,GSTmRNA表达水平增高；与模型组相比，除半夏泻心汤低剂量组外，半夏泻心汤中、高剂量组及维酶素组均能显著降低CAG大鼠胃黏膜中Nrf2,NQO1,GSTmRNA表达水平（P<0.05），其中半夏泻心汤高、中剂量组在调节Nrf2,NQO1,GSTmRNA表达水平方面差异无统计学意义，半夏泻心汤高、中剂量组在调节降低Nrf2,GSTmRNA表达水平方面优于维酶素组（P<0.05），但在调节NQO1mRNA表达水平方面，半夏泻心汤高、中剂量组与维酶素组间无显著差异。见表4。

4、讨论

中医认为CAG发病多因饮食不节（洁）、情志不畅、外邪入侵、素体脾虚等，导致脾胃运化失司而湿邪内蕴，阻滞气血，久则耗气伤阴而发展为虚实寒热错杂之证，并按其症状以胃脘痞满、嗳气频频归属于“胃痞证”“嗳气”的范畴。故治疗时应健脾益气、和胃降逆，消痞散结，并依据患者病证寒热选择温中散寒或清热泻火之品。临床观察亦发现患者表现均有病情虚实夹杂、脾胃阴阳失调等特征，常见辨证分型为脾胃虚弱型，治疗多以调和脾胃阴阳为主[12]。

半夏泻心汤中半夏和胃降逆，消痞散结为君；干姜温中散寒，黄芩、黄连清泄里热为臣；人参、炙甘草、大枣益气健脾，和中补虚为佐。此方中药味有辛有苦，药性有寒有温，辛主升主开，苦主降主泄，寒清热，温祛寒，是调和脾胃阴阳的代表方剂。现代药理研究发现半夏泻心汤具有保护胃黏膜、抗胃肠道肿瘤的作用[13]。

近年来的研究证实，半夏泻心汤可调节CAG大鼠炎症因子[14]、胃蛋白酶原及胃泌素含量[15,16]从而达到治疗CAG的目的，亦有学者通过网络药理学研究发现半夏泻心汤可能通过调节炎症反应、免疫功能、氧化应激和血管生成等对CAG发挥治疗作用[17]。

Keap1/Nrf2/ARE信号通路为机体内抗氧化应激的主要通路之一，可以抵抗内外界氧化和化学物质等刺激导致的氧化应激反应，提高细胞的抗氧化应激和修复功能，能防止正常细胞发生癌变[18]。在生理情况下，Nrf2与Keap1结合并以非活性状态存在于胞浆中，经泛素化后迅速降解，此时Nrf2保持低转录活性[19]。当细胞受到某些致癌物刺激后，Nrf2与Keap1解偶联活化并转运进入细胞核，之后与抗氧化反应原件（AREs））结合[20]，激活Keap1/Nrf2/ARE信号通路。该通路被激活后，可启动下游多种靶蛋白的表达[21,22,23]，诸如NQO1,GST,SOD,GSH-Px等，从而增强细胞及组织对氧化应激的抵抗性，恢复氧化-抗氧化的平衡而防止疾病的发生。NQO1是一种同源二聚体黄素酶，够阻止环境胁迫剂对DNA造成氧化损伤且在保护内源性抗氧化剂中起重要作用。GST是体内解毒酶系统的重要组成部分，能将体内各种毒性物质降解并排出体外。当生物体遭受致癌物、氧化刺激等损伤时，GST可以发挥解毒和抗氧化作用[24]。但若Nrf2在受到刺激后一直处于高转录活性，使得下游具有抗氧化作用的靶基因NQO1,GST表达水平过高，则有可能导致机体始终处于过度抗氧化状态，而进一步破坏氧化-抗氧化平衡，导致疾病的发生甚至导致发育性致死[25]。CAG有可能发生肠化或不典型增生而进一步癌变。有研究发现Nrf2在胃癌组织及细胞中呈现高表达状态[26]，说明Nrf2过度活化可能导致胃黏膜由萎缩的癌前状态而发展为胃癌，对肿瘤发生有一定的促进作用。这时候就需要Keap1与Nrf2重新结合，恢复偶联状态并进入细胞质，之后Keap1将Nrf2与Cul3-E3泛素连接酶连接，促进Nrf2的泛素化和降解，关闭Nrf2通路，实现细胞稳态[27,28]。因此Keap1/Nrf2/ARE信号通路可作为治疗CAG，防止其癌变的潜在靶点之一。

本研究结果显示CAG大鼠胃黏膜组织Nrf2,NQO1,GST蛋白及mRNA表达较正常组升高，胃黏膜萎缩，甚至肠化，处于癌前状态，说明在受到致癌物MNNG刺激后，Nrf2处于高转录活性状态，使得抗氧化蛋白表达过高，机体抗氧化过度，这可能是CAG发生的机制之一。维酶素组及半夏泻心汤高、中剂量组Nrf2,NQO1,GST蛋白及mRNA表达水平较模型组降低，胃黏膜萎缩、肠化情况明显改善，但半夏泻心汤低剂量组作用不明显，提示一定剂量的药物干预可以防止因异常刺激而导致的Nrf2高活性状态，下调过度高表达的NQO1,GST，且以高剂量组改善最为明显，说明半夏泻心汤可能通过促使KEAP1和Nrf2重新结合并进入细胞质，促进Nrf2泛素化降解，从而关闭Nrf2通路，使细胞恢复稳态，恢复机体正常的氧化-抗氧化平衡状态，胃黏膜损伤恢复正常，起到治疗CAG，防止癌变的目的。随着半夏泻心汤浓度的升高，Nrf2泛素化降解速度加快，Nrf2信号通路被关闭，因此其下游靶基因NQO1,GST表达水平也随之降低。

综上所述，本研究表明CAG的发生可能与Keap1/Nrf2/ARE信号通路中Nrf2始终处于高转录活性，NQO1,GST等表达过高，机体处于过度抗氧化状态相关。半夏泻心汤能够明显修复受损的胃黏膜组织，其作用机制可能是降低Nrf2的转录活性，关闭Nrf2信号通路，降低NQO1,GST的表达水平，实现正常的氧化-抗氧化平衡，体现了中药调节机体内环境，恢复机体平衡状态而防治疾病的作用机制。且本研究发现半夏泻心汤高剂量组疗效更加显著，说明半夏泻心汤在治疗CAG方面存在明显的量效关系，为临床应用浊毒理论防治CAG提供了客观依据。但中药复方是通过多途径、多靶点而发挥治疗疾病的作用，半夏泻心汤中药味较多，具体是哪几味药的哪些成分通过调控信号通路而起到治疗CAG的效果尚不明确，且本研究只检测了CAG大鼠胃黏膜中Nrf2的表达量，不能明确半夏泻心汤是否真的能够促进Nrf2和KEAP1重新耦联并进入细胞质内从而关闭Nrf2通路，在今后的研究中可进行中药组分及细胞学的相关研究，以明确半夏泻心汤治疗CAG的具体作用机制。

文章来源：石铖,王茜,刘宇,郝蕾,韩雪,王彦刚.基于Keap1/Nrf2/ARE信号通路探讨半夏泻心汤对慢性萎缩性胃炎大鼠的影响及作用机制[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(20):31-37