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眼睑基底细胞癌差异基因的筛选和分析

2024-06-07 50 上传者：管理员

摘要：目的采用RNA测序技术对眼睑基底细胞癌差异基因进行筛选和分析。方法选取2021年7月至11月因眼睑基底细胞癌就诊于河北省眼科医院并行扩大切除及一期眼睑重建的患者6例，分别取切除的部分癌组织及修复缺损时修剪的癌旁正常组织各一块进行研究。通过RNA测序技术进行建库测序。使用DESeq2软件设定P<0.05及|log2(foldchange)|> 1为显著差异表达的阈值。鉴定出差异表达的基因。采用clusterProfiler软件对差异基因集进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，进一步分析这些特异性基因的生物学意义。结果使用DESeq2软件进行癌组织和癌旁组织之间的差异表达分析，共筛选出1 317个差异基因，其中在6例癌组织中表达上调的基因有906个，表达下调的基因有411个。GO富集分析结果中上调最显著的前30个差异基因主要富集于体液免疫反应、免疫球蛋白复合物、B细胞受体信号通路、细胞外基质、抗原结合、受体调节剂活性等方面。下调基因前10位在生物过程、细胞组成、分子功能层面主要与表皮发展相关。KEGG通路富集主要集中在黑色素生成通路及WNT信号通路、免疫相关信号通路等，相关基因通路有8个。根据基因上调的显著性由大到小，最终确定核心基因包括FZD2、PTCH1、WNT7B、TCF3、MMP-9、TEAD2。结论基底细胞癌的发生与各种通路相互影响和共同作用密切相关，各种高表达基因中，FZD2、PTCH1、WNT7B、TCF3、MMP-9、TEAD2在眼睑基底细胞癌患者组织中表达升高最显著，与眼睑基底细胞癌的发生和发展有密切关系。

关键词：
信号通路
基底细胞癌
富集分析
差异基因
生物信息学
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眼睑基底细胞癌是皮肤最常见的恶性肿瘤，起源于表皮及皮肤附属器的基底细胞层。基底细胞癌的常见危险因素包括日晒、人种、年龄、儿童期雀斑史[1]。多发生于头颈部等暴露部位。眼部以下睑内眦部多见，男性多发于女性，老年人多于年轻人[2]。绝大多数基底细胞癌生长缓慢，并且极少转移，但是当它发生局部转移时，周围组织结构会被破坏，对眼睑功能及面部外观产生影响。随着现代分子生物学和肿瘤学研究的发展，人们逐渐认识到恶性肿瘤的发生系多因素、多阶段、多基因异常累计的过程[3]。本研究对临床及病理确诊的眼睑基底细胞癌患者行病变扩大切除及一期眼睑重建，收集部分癌组织及癌旁正常组织，通过建库测序和生物信息学分析，对眼睑基底细胞癌差异基因进行筛选和研究。

1、资料与方法

1.1 一般资料

选取2021年7月至11月因眼睑基底细胞癌就诊于河北省眼科医院并行扩大切除及一期眼睑重建的患者6例，分别取切除的部分癌组织及修复缺损时修剪的癌旁正常组织各一块，存放于-20 ℃冰箱快速冷冻及保存，进行研究。本研究已经获得我院医学伦理委员会批准(批号：2022KY22),并遵循《赫尔辛基宣言》所要求的伦理学原则，患者均知情并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及测序

使用TRIzol Reagent试剂盒(美国Invitrogen公司)提取6例患者癌组织和癌旁组织的总RNA,分别采用Qubit2.0 Fluorometer和Agilent 2100 Bioanalyze定量检测RNA完整值。根据TruSeq DNA Library Prep Kit(美国Illumina公司)说明书，进行cDNA合成、末端修复、连接接头及扩增纯化，最终获得cDNA文库。将构建好的文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求Pooling 后进行Illumina NovaSeq 6000 测序。

1.2.2 数据分析

测序获得的原始数据通过去除带接头(adapter)的Reads、含无法确定碱基信息的Reads和低质量Reads(Qphred≤20的碱基数占整个Read长度的50%以上的Reads)得到有效序列。

使用HISAT2软件将Clean Reads与参考基因组进行快速精确的比对，获取Reads在参考基因组上的定位信息[4]。采用featureCounts(1.5.0-p3)计算映射到每个基因的读数。然后根据基因的长度计算每个基因的FPKM,并计算映射到该基因的读数。使用DESeq2软件(1.20.0)进行癌组织和癌旁组织之间的差异表达分析，通过Benjamini和Hochberg 的方法来调整所得P值以控制错误发现，设定P<0.05及| log2[foldchange(差异倍数)]|> 1为显著差异表达的阈值。

通过clusterProfiler(3.8.1)软件实现差异表达基因的GO富集分析，其中修正了基因长度偏差，使用clusterProfiler(3.8.1)软件分析KEGG通路中差异表达基因的统计富集。

2、结果

2.1 转录组测序结果

采用Illumina NovaSeq 6000 测序仪对6例癌组织及癌旁组织进行转录组测序，12 份样品共测序81.9 G Raw data, 去除低质量序列后获得有效数据77.2 G Clean data。各样品的Q30均在94.56%以上，表明转录组测序数据量丰富且质量良好。

2.2 差异表达基因筛选结果

使用DESeq2软件(1.20.0)进行癌组织和癌旁组织之间的差异表达分析，共筛选出1 317个差异基因，其中在6例癌组织中表达上调的基因有906个，表达下调的基因有411个。根据所得结果绘制的差异表达基因分析火山图见图1。

图1 差异表达基因分析火山图

2.3 差异表达基因GO功能分析结果

GO富集分析结果中上调最显著的前30个差异基因主要富集于体液免疫反应、免疫球蛋白复合物、B细胞受体信号通路、细胞外基质、抗原结合、受体调节剂活性等方面。下调基因前10位在生物过程、细胞组成、分子功能层面主要与表皮发展相关。

2.4 差异表达基因KEGG通路富集分析结果

将1 317个差异基因进行KEGG通路富集分析结果显示，KEGG通路富集主要集中在黑色素生成通路及WNT信号通路、免疫相关信号通路等，相关基因通路有8个。Basal cell carcinoma通路中FZD2、PTCH1、WNT7B基因表达升高明显，NF-kappa B signaling pathway信号通路中主要是IGHV系列基因及BCL2A1基因表达升高，Transcriptional misregulation in cancer信号通路中IGHV系列基因、TCF3、MMP-9基因表达上调显著，另外Breast cancer、Gastric cancer、Melanogenesis信号通路中FZD2、WNT7B基因表达上调明显，Calcium signaling pathway信号通路中IGHV3系列基因及NOS2基因表达上调明显，Hippo signaling pathway信号通路中FZD2、WNT7B、TEAD2基因表达上调明显，cAMP signaling pathway信号通路中TSHR、ABCC4基因表达明显增强。根据基因上调的显著性由大到小，最终确定核心基因包括FZD2、PTCH1、WNT7B、TCF3、MMP-9、TEAD2(表1)。

表1 KEGG通路富集分析所得核心基因

3、讨论

眼睑基底细胞癌是最常见的眼睑恶性肿瘤，好发于中老年人，紫外线照射为其危险因素。眼睑恶性上皮肿瘤中85%～95%为眼睑基底细胞癌，其次是鳞状细胞癌、皮脂腺癌和恶性黑色素瘤[5]。75%以上的基底细胞癌发生在头颈部，大部分呈结节状皮损，也可进展为经久不愈的溃疡。眼睑基底细胞癌需要与睑板腺癌、黑色素瘤、鳞状细胞癌等疾病进行鉴别[6]。目前，基底细胞癌的治疗主要以手术切除为主，术后复发的风险为5%～15%[7]。因基底细胞癌的基因研究一直备受国内外学者的关注，我们将眼睑基底细胞癌组织及癌旁组织进行了基因对比，筛选差异基因，发现筛选出的差异基因富集的信号通路结构复杂，不同的信号通路之间存在多种交叉因子，说明多种信号通路相互交织、相互影响，在眼睑基底细胞癌发生的过程中发挥着极其复杂的作用。

眼睑基底细胞癌好发于常染色体显性遗传疾病痣样基底细胞癌综合征(NBCCS),本病的发生与常染色体上的PTCH基因突变有关，PTCH基因又称NBCCS基因，果蝇发育基因patched与其核苷酸和氨基酸分别有67%和60%的同源性，干预细胞的生长分化和发育[8]。大多数基底细胞癌患者存在PTCH基因突变或染色体9q22.3区域的杂合性缺失，导致FFCH蛋白的截短或不稳定。研究显示PTCH基因是一种抑癌基因，然而当其发生突变或失活时，可导致下游靶基因被持续激活从而发生肿瘤。根据肿瘤“二次突变”学说，PTCH基因在NBCCS患者出生后体细胞中只需发生二次突变，便可形成肿瘤。因此，NBCCS患者较散发基底细胞癌患者发病的年龄更小，且呈多发性。正常情况下，PTCH基因的表达水平非常低，但在基底细胞癌中，使用Northern印迹法和原位杂交方法可以很容易检测到PTCH基因表达水平呈上调趋势。Undén等[9]研究发现，16例基底细胞癌患者中有11例散发性肿瘤和3例遗传性肿瘤患者均有9q3.1等位基因的缺失。表明9q2.2存在的PTCH基因是一种肿瘤易感的基因，PTCH的突变可引发基底细胞癌，但基底细胞癌的形成还需要其他基因的突变。

WNT信号通路在胚胎发育、组织分化和细胞再生中起着重要作用[10],其失调与胚胎畸形、神经退行性疾病和肿瘤等疾病的发生密切相关[11]。WNT信号通路在表皮干细胞的发育、角质形成细胞增殖以及皮肤稳态再生中发挥作用。WNT与Frizzled(FZD)家族的细胞表面受体结合后形成复合体，继而与低密度脂蛋白相关蛋白5/6或酪氨酸激酶受体(PTK7、ROR、RYK)结合，激活Dishevelled蛋白，最终触发多种信号级联。它的异常调控不仅会引起肿瘤的发生、发展，还能促进肿瘤复发[12]。Bonifas等[13]在培养的基底细胞癌组织细胞中发现其表达5个不同的WNT系列成员(2、2b、4、5a和7b),其中WNT7b最常见。陈奕鹤等[14]发现， WNT7b在人恶性黑色素瘤细胞系 A375、SK-MEL-28、A875中均有表达，其中在A375细胞系中表达量最高。基底细胞癌患者瘤体均有不同程度的黑色素细胞增生，WNT7b通过影响基底细胞癌中黑色素细胞的增生从而影响肿瘤的生长。FZD2基因主要编码人类Frizzled-2蛋白，而Frizzled基因可以编码7 种跨膜蛋白，其N2端有富含半胱氨酸的域，能以高亲和力结合WNT。FZD2基因的表达似乎是受发育调节的，在胎儿肾和肺以及成年结肠和卵巢中具有高水平的表达。Zhou等[15]研究发现，AXIN1、CTNNB1、Lef1、fzd2、fzd4为5个关键的WNT信号通路相关基因，在癌组织和正常组织中的表达量存在差异。FZD2作为WNT通路的一员参与癌组织的生成与发展。Li等[16]认为GNAS、FZD2和FZD10是可能与肺鳞状细胞癌患者预后相关的三个核心基因。很少有文献报道FZD2与基底细胞癌发病相关，但我们研究发现FZD2在眼睑基底细胞癌多个信号通路中均高表达。

基质金属蛋白酶(MMP)属于依赖锌的金属蛋白酶家族，MMP-9是明胶酶 B 家族成员之一，是最复杂的MMP之一[17]。MMP-9在细胞外间质重塑中的重要作用表明其与癌症发病和进展关系密切。MMP可在多种人类癌症中检测到，MMP的高表达通常与大多数癌症患者的生存率降低有关，其中MMP-2和MMP-9能够降解基底膜中的IV型胶原，是研究最广泛的金属蛋白酶，与结直肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌和胃癌等癌症的进展和生存率有关。Manola等[18]研究发现，皮肤基底细胞癌患者癌周组织中MMP-9与MMP-2的表达高于肿瘤细胞。Mondal等[19]报道，癌细胞分泌多种细胞因子，如干扰素、白细胞介素和生长因子，以及细胞外MMP诱导因子，刺激周围宿主细胞产生肿瘤细胞所需的MMP。已确定MMP-9在血管生成、转移和癌症侵袭中的作用，MMP-9还负责癌细胞的存活和扩散。癌细胞以旁分泌方式，通过分泌白细胞介素、干扰素、生长因子和细胞外MMP诱导因子，刺激周围宿主细胞产生所需的MMP。

TCF3又称转录因子3,该基因编码E蛋白 (I 类) 螺旋-环-螺旋转录因子家族成员。E蛋白通过以异二聚体或同二聚体的形式与靶基因上的调节性E-box序列结合来激活转录，并被DNA结合螺旋-环-螺旋蛋白抑制剂的异二聚化所抑制。E蛋白在淋巴细胞生成中起关键作用，编码的蛋白是B和T淋巴细胞发育所必需的。Doglioni等[20]研究发现TCF-3在基底细胞癌和螺旋腺瘤中高表达。

巴塞尔大学生物中心研究发现，在肝细胞癌中，乙酰辅酶A的合成受到转录因子TEAD2和E2A的抑制，造成非组蛋白乙酰化减少，这提示抑制乙酰辅酶A的合成可促进致癌去分化和增殖[21]。Saito等[22]报道，TAZ和MET/CTNNB1-S45Y驱动的肝细胞肝癌需要TEAD2和TEAD4的表达，其中TEAD2对肝细胞肝癌增殖有促进作用。Yoo等[23]研究发现，基底样亚型胰腺导管腺癌细胞含有TEAD2依赖性促血管生成增强子。

本研究发现，多种信号通路和相关基因共同作用可以影响眼睑基底细胞癌的发生与发展。然而本研究样本量较小，需要进一步增加样本来验证这些基因的高表达。此外，还需要进行动物实验来研究FZD2与WNT7B作为肿瘤标志物及治疗靶基因的潜在作用。

4、结论

基底细胞癌的发生与多种通路相互影响和共同作用密切相关，各种高表达基因中，FZD2、PTCH1、WNT7B、 TCF3、MMP-9、TEAD2在眼睑基底细胞癌患者组织中表达升高最显著，与眼睑基底细胞癌的发生和发展有密切关系。

参考文献:

[2]刘家琦,李凤鸣.实用眼科学[M].第3版.北京:人民卫生出版社,2010.

[12]陈佳静,李超鹏,王其龙,王飞.Hedgehog及WNT信号通路在眼睑基底细胞癌中的研究进展[J].国际眼科杂志,2022,22(11):1822-1826.

[14]陈奕鹤,马立文,殷旭峰,吴迪,骆丹.WNT7b促进黑素瘤细胞的迁移､侵袭与上皮间质转化[J].南京医科大学学报(自然科学版),2021,41(9):1322-1328.

基金资助:河北省社会发展领域专项基金(编号:2022ZC236);

文章来源:杨俭伟,宋丽华,王娟,等.眼睑基底细胞癌差异基因的筛选和分析[J].眼科新进展,2024,44(06):454-457.