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膀胱癌细胞增殖和迁移的影响

2023-10-09 49 上传者：管理员

摘要：目的探讨早期生长反应因子1(EGR1)在膀胱癌中的表达，分析其表达上调对膀胱癌细胞增殖和迁移的影响。方法用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测膀胱癌细胞系J82、UM-UC-3、T24和人正常膀胱上皮细胞SV-HUC中EGR1 mRNA的表达水平。以T24细胞为研究对象，分为空白组(未进行任何处理)、NC组(转染negative control)和EGR1组(转染EGR1)。用细胞计数试剂盒-8检测细胞的增殖能力，用流式细胞术检测细胞的凋亡情况，用划痕实验法检测细胞的迁移能力，用蛋白质印迹法检测神经钙黏附蛋白(N-Cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白的表达水平。结果在膀胱癌J82、UM-UC-3、T24、SV-HUC细胞中EGR1 mRNA表达量分别为0.58±0.10、0.76±0.13、0.39±0.02和1.00±0.07;与SV-HUC细胞相比，膀胱癌J82、UM-UC-3和T24细胞的EGR1 mRNA表达量均显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.01)。EGR1组、NC组和空白组的细胞增殖活力分别为(70.38±...

关键词：
中晚期妇科恶性肿瘤
增殖
早期生长反应因子1
膀胱癌
迁移
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膀胱癌是一种常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤，以血尿为最常见的症状，死亡率较高。男性发病率是女性的3倍，吸烟是膀胱癌最常见的危险因素，除此之外，遗传背景、饮食习惯和饮酒也与膀胱癌发病相关[1,2]。虽然放疗和化疗被认为是晚期膀胱癌患者的常用治疗方法，但远处复发和转移导致治疗效果有限，预后不佳。早期生长反应基因1(early growth response 1,EGR1)作为一种含有锌指域的转录因子，可特异性识别和结合靶基因并调控其转录。EGR1表达与白血病、肝癌、乳腺癌和结肠癌等肿瘤的发生有关，其既可以作为原癌基因，也可以作为抑癌基因，目前已经成为研究热点[3,4]。本实验旨在探讨EGR1表达上调对膀胱癌细胞增殖和迁移的影响及其机制，为未来治疗膀胱癌提供理论依据。

1、材料

细胞人膀胱癌细胞系J82、UM-UC-3、T24和人正常膀胱上皮SV-HUC细胞，均购自美国ATCC公司。

试剂胎牛血清，购自美国Invitrogen公司；细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)试剂盒、Lipofectamine 2000、negative control、EGR1 cDNAs,均购自上海吉玛制药技术有限公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、兔源神经钙黏附蛋白(neuro-cadherin, N-Cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)抗体，均购自武汉博士德生物工程有限公司；反转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)试剂盒，均购自沈阳万类生物科技有限公司。

仪器JYH27020电泳仪，美国Bio-Rad公司产品；ELX800酶标仪，美国Bio-Tek仪器公司产品；LEXTOLS4500激光共聚焦显微镜，日本奥林巴斯有限公司产品。

2、实验方法

2.1细胞培养[5]5]

人正常膀胱上皮细胞SV-HUC、人膀胱癌细胞系J82、UM-UC-3和T24均培养在含10%胎牛血清和100 U·L-1青链霉素的1640培养基中，置于5%CO2、37℃恒温培养箱中，每隔2～3 d,用0.25%胰蛋白酶进行消化传代。

2.2用qRT-PCR法检测EGR1 mRNA的表达水平[5]5]

从膀胱癌细胞系J82、UM-UC-3、T24及人正常膀胱上皮细胞SV-HUC中提取总RNA,然后用逆转录试剂盒反转录为cDNA。取cDNA反应产物3μL进行扩增获取目标基因，每组样品进行一式3份定量PCR检测。以GAPDH分别作为EGR1的内源性对照，反应体系如下：95℃预变性10 min, 95℃变性12 s, 65℃退火10 s, 72℃延伸20 s,共35个循环。用2-△△Ct相对定量法计算EGR1的相对表达量。

2.3细胞转染和分组处置

取T24细胞，按照每孔加1.0×105个细胞接种到24孔板内，按照转染试剂Lipofectamine 2000说明书的方法进行细胞转染。收集对数生长期细胞，分为空白组(未进行任何处理)、NC组(转染negative control)和EGR1组(转染EGR1)。

2.4用CCK-8法检测细胞的增殖能力[6]6]

将处于对数生长期的T24细胞，用0.25%胰蛋白消化，培养于96孔板中，并设计3个复孔。当细胞生长密度达到80%时，在第0和48 h分别加入CCK-8试剂10μL,继续孵育2 h,用酶标仪在450 nm处检测光密度(optical density, OD)值，计算细胞增殖活力。细胞增殖活力=(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100%。

2.5用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况[7]7]

将T24细胞接种到6孔板，每孔2.0×105个细胞，按“2.3”中方法进行分组和处理，培养48 h后，收集细胞，用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution, PBS)反复洗涤2次后，加入结合缓冲液500μL悬浮细胞。在细胞中添加膜联蛋白V-FITC 5μL,继续添加碘化丙啶5μL,在室温条件下结合15 min。用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况

2.6用划痕实验检测细胞的迁移能力[8]8]

将T24细胞以每孔5.0×106个细胞常规培养于6孔板中，当培养的细胞融合达到90%以上时，用200μL移液器吸头尖端刮除细胞单层，每孔用PBS冲洗漂浮细胞，在无血清的培养基中培养。在倒置光学显微镜下，分别于0、24 h在100倍的放大倍数下拍照获得图片。

2.7以蛋白质印迹法检测N-Cadherin、Vimentin和MMP-9蛋白的表达水平[9]9]

收集裂解细胞，在4℃下，以1.2×104 r·min-1离心10 min。用二喹啉甲酸法进行蛋白定量，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离后电转移至聚偏二氟乙烯膜，孵育30 min,通过凝胶成像分析系统，以GAPDH为内参对照，计算各个样本蛋白条带与GAPDH条带的灰度比值，作为目的蛋白的相对表达水平。

3、统计学处理

用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料用x¯±s

表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验。

结果

1 EGR1 mRNA在膀胱癌细胞系J82、UM-UC-3、T24和人正常膀胱上皮细胞SV-HUC中的表达

膀胱癌细胞系J82、UM-UC-3、T24和SV-HUC细胞中EGR1 mRNA表达量分别为0.58±0.10、0.76±0.13、0.39±0.02和1.00±0.07。与SV-HUC细胞相比，J82、UM-UC-3、T24的EGR1 mRNA表达量均显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.01)。

2 EGR1表达上调对细胞增殖的影响

NC组转染negative control, EGR1组转染EGR1,空白组未进行任何处理。

空白组、NC组、EGR1组在48 h细胞增殖活力分别为(90.30±3.05)%、(92.14±5.10)%和(70.38±4.69)%。与空白组和NC组比较，EGR1组的细胞增殖活力均显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.01)。

3 EGR1表达上调对细胞凋亡的影响

空白组、NC组和EGR1组的细胞凋亡率分别为(10.07±1.20)%、(12.39±2.01)%和(40.83±4.21)%。与空白组和NC组比较，EGR1组的细胞凋亡率均显著增加，差异均有统计学意义(均P<0.01)。

4 EGR1表达上调对细胞迁移能力的影响

划痕24 h后，空白组、NC组和EGR1组的细胞迁移率分别为(90.76±4.53)%、(92.34±4.60)%和(30.80±3.76)%,见图1。与空白组和NC组比较，EGR1组的细胞迁移能力均显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.01)。

5 EGR1表达上调对N-Cadherin、Vimentin和MMP-9蛋白表达水平的影响

如图2所示：空白组、NC组和EGR1组的N-Cadherin蛋白相对表达水平分别为0.27±0.02、0.30±0.02和0.15±0.03,Vimentin蛋白相对表达水平分别为0.47±0.04、0.46±0.05和0.19±0.02,MMP-9蛋白相对表达水平分别为0.37±0.05、0.35±0.02和0.13±0.01;与空白组和NC组比较，EGR1组的N-Cadherin、Vimentin和MMP-9蛋白相对表达水平均显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.01)。

4、讨论

EGR1在肿瘤的进展中发挥着重要的调控作用，其可通过识别并结合基因启动子中特异的DNA序列调控下游靶基因转录，从而调控细胞的增殖分化[5]。为了探索EGR1在膀胱癌发生中的作用，本研究分析了其在膀胱癌组织和细胞系中的表达水平，结果发现，EGR1在膀胱癌中表达下调，且上调EGR1的表达可以增加膀胱癌细胞的凋亡率，抑制增殖活力和迁移能力。在正常人体组织细胞中，N-Cadherin表达水平较低。然而，N-Cadherin在神经组织和多种恶性肿瘤中高表达，这表明N-Cadherin很有可能在肿瘤侵袭中是以启动子的形式来发挥作用。N-Cadherin可以通过提高肿瘤细胞集体迁移能力、激活成纤维细胞生长因子受体和调节磷脂酰肌醇-3激酶信号转导通路等途径来促进肿瘤转移[10]。Vimentin是中间丝蛋白的一种，在上皮-间充质转化过程中起着重要的作用，这一过程对癌症转移至关重要，靶向抑制Vimentin可以减少癌症的生长和扩散，延长患者的生存期[11]。MMP的主要功能是降解细胞外基质，在许多生物学过程中发挥作用，如组织重塑和生长、胚胎发育、器官发生、血管形成、创伤修复、炎症调控、组织防御机制和免疫应答等。其中，MMP-9在肿瘤细胞迁移中发挥着重要作用，其可以调控细胞黏附和细胞生长，从而影响肿瘤细胞的活性和功能，降低或阻断MMP-9的表达则可以减少肿瘤转移的发生[12]。本研究结果发现，EGR1表达上调可以降低N-Cadherin、Vimentin和MMP-9蛋白的表达水平，从而抑制膀胱癌细胞的迁移。

因此，EGR1表达上调可以抑制膀胱癌细胞的增殖和迁移，其机制可能与降低N-Cadherin、Vimentin和MMP-9蛋白表达水平有关。这说明EGR1有可能成为膀胱癌的潜在治疗靶点，为膀胱癌的治疗提供了一个新的方向。

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