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膀胱尿路上皮癌中连接黏附分子A蛋白表达及临床意义

2025-03-10 62 上传者：管理员

摘要：目的检测连接黏附分子A(junctionaladhesionmolecule-A,JAM-A)在膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma,BUC)中的表达状况，探讨JAM-A蛋白表达与尿路上皮癌发生发展以及临床病理指标的关系及意义。方法采用免疫组织化学SP法和Western blot方法检测了尿路上皮癌和癌旁组织中JAM-A表达状况，探讨JAM-A在各组间表达的差异及与临床病理特征之间的关系。结果免疫组织化学SP法结果显示20例癌旁组织中JAM-A表达只有3例(15%)阳性，而肿瘤组织中JAM-A表达阳性率为100%(119/119),JAM-A蛋白表达显著高于癌旁组织(P<0.001);Western blot结果 JAM-A蛋白表达在尿路上皮癌组织表达量(4.23±0.68)显著高于癌旁组织(2.18±0.57)，差异有高度统计学意义(P<0.001)，相关性分析结果显示JAM-A蛋白表达与尿路上皮癌浸润、淋巴结转移相关；JAM-A蛋白高表达与尿路上皮癌浸润(P<0.05)、淋巴结转移(P<0.001)呈正相关，而与慢性炎症、性别、年龄均无相关性。ROC结果显示，JAM-A在尿路上皮癌病理诊断中AUC值为0.878，灵敏度为66.4%、特异度为85%。结论尿路上皮癌中JAM-A高表达对病理诊断有一定的价值；与JAM-A蛋白低表达相比较，JAM-A蛋白高表达更容易发生浸润和淋巴结转移，表明JAM-A蛋白高表达参与了尿路上皮癌的发生发展过程，可能对临床不良预后有一定的参考意义。

关键词：
JAM-A蛋白
免疫组织化学
尿路上皮癌
膀胱肿瘤
蛋白免疫印迹
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2022年WHO国际癌症研究机构(IARC)发布的全球恶性肿瘤统计报告中显示,膀胱癌新发病例占第9位,死亡率占第13位[1]｡膀胱癌作泌尿系统最常见的恶性肿瘤,居中国恶性肿瘤发病谱第13位,是威胁我国居民健康的主要恶性肿瘤之一｡膀胱､肾盂､输尿管被覆尿路上皮,尿路上皮来源的恶性肿瘤称为尿路上皮癌,90%的尿路上皮癌发生于膀胱[2]｡膀胱尿路上皮癌易复发､治疗手段有限且多次复发后治疗效果欠佳,预后差｡连接黏附分子A(junctionaladhesionmoleculeA,JAM-A)是上皮细胞之间或内皮细胞之间的紧密连接,不仅存在于正常上皮细胞､内皮细胞和白细胞等,也存在于各种类型的癌组织中｡最近研究报道JAM-A蛋白在乳腺癌[3]､食管癌[4]､鼻咽癌[5]中高表达并与肿瘤增殖､进展相关,而且在头颈部鳞状细胞癌中通过下调JAM-A表达从而抑制了肿瘤的侵袭和迁移[6],反向验证了JAM-A高表达可以促进肿瘤的恶性进展｡然而在膀胱尿路上皮癌中JAM-A蛋白表达状况以及与尿路上皮癌的关系不清楚,因此,本研究旨在探讨尿路上皮癌中JAM-A蛋白表达状况及与临床病理指标的相关性,为后续应用JAM-A协助诊断和判断预后提供临床价值｡

1、材料与方法

1.1材料尿路上皮癌和癌旁组织标本全部来自包头市中心医院病理科2020—2024年存档蜡块,癌旁组织20例,尿路上皮癌119例｡根据尿路上皮癌是否浸润分为两组:浸润性尿路上皮癌57例,非浸润癌62例;淋巴结转移7例,无淋巴结转移112例;有慢性炎症50例,无明显慢性炎症69例,并选择20例癌旁组织为正常对照组｡对照组纳入标准:黏膜炎症轻微,无鳞状上皮化生､无腺性膀胱炎,无上皮内瘤变等病变｡患者年龄42~90岁,其中男105例,女14例,标本组织够诊断使用,资料记录完整,所有病理诊断结果均是双人双核对｡所有标本均经过患者及家属同意,并通过了包头市中心医院伦理委员会许可[编号:KYLL2022(伦)014号]｡

1.2免疫组织化学方法免疫组化染色采用常规SP法｡免疫组化切片脱蜡后,用新鲜配置的0.3%过氧化氢阻断剂在37℃下孵育30min,再用柠檬酸盐缓冲液抗原修复10min,之后用正常山羊血清3℃下封闭30min,去掉封闭液后滴加一抗工作液JAM-A(Abcam公司产品,稀释度1∶100),室温下孵育30min,湿盒内4℃孵育过夜｡第2天,滴加用生物素标记羊抗鼠/兔聚合物及辣根过氧化物酶标记卵白素工作液,室温下分别孵育30min,用PBS洗涤后加入DAB染液,室温下避光孵育5min,用自来水冲洗,苏木素染色2min分化返蓝,再脱水､透明､封片,制片完成｡JAM-A兔抗人单克隆抗体为美国Abcam公司产品,细胞膜着色,根据文献[7]判定标准,对肿瘤细胞进行半定量评分:细胞膜未见染色为0,10%以上的细胞膜染色弱且不完整为1+;10%以上细胞弱至中度完全膜染色为2+;10%以上的细胞有强烈而完整的膜染色为3+｡Her-2评分标准[8]浸润癌细胞膜无着色或<10%不完全且微弱染色为0分;≥10%浸润性癌细胞膜不完全且微弱染色为1分;≥10%浸润性癌细胞膜弱-中等强度的完整胞膜染色或<10%浸润性癌细胞完整细胞膜强染色,则为2分;≥10%浸润性癌细胞完整细胞膜强染色为3分｡

1.3Western-blot方法使用蛋白裂解液(RIPA)和蛋白抑制剂提取尿路上皮癌和癌旁组织中的总蛋白｡之后用BCA蛋白质测定试剂盒来检测所提取的蛋白质浓度,并通过12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来分离蛋白质,再将其转移至PVDF膜｡先用5%脱脂牛奶封闭膜2h,之后将膜与JAM-A一抗溶液(1∶500)在4℃下孵育过夜杂交｡第2天用TBST洗涤膜3次后与二抗溶液室温下孵育2h｡再用ECL化学底物试剂处理PVDF膜,显影分析并记录蛋白条带和内参条带的灰度值并统计｡

1.4统计学方法采用SPSS29.0软件分析,两组间比较采用t检验,并以均数±标准差(x±s)表示｡计数指标用率[n(%)]表示,组间比较采用χ2检验,ROC曲线分析JAM-A表达对尿路上皮癌的诊断价值,P0.05表示差异具有统计学意义

2、结果

2.1免疫组化检测膀胱尿路上皮癌和癌旁组织中JAM-A蛋白表达状况JAM-A蛋白免疫组化染色阳性表达在尿路上皮癌及癌旁组织中为细胞膜黄色或黄褐色着色,可以存在胞质胞膜均染色情况,但是胞质染色不应该掩盖胞膜着色｡在免疫组化检测中发现,在癌旁组织中JAM-A蛋白基本不着色,20例癌旁组织中仅3例JAM-A蛋白表达阳性15%(3/20),而在尿路上皮癌里JAM-A蛋白免疫组化细胞膜染成黄色或黄褐色着色,颜色存在差异,但是JAM-A蛋白全部表达100%(119/119),显著高于癌旁组织(χ2=107.462,P<0.001),见图1｡

图1癌旁组织和尿路上皮癌中JAM-A蛋白免疫组化染色结果,S-P法

2.2Western-blot方法检测尿路上皮癌和癌旁组织中JAM-A蛋白表达状况JAM-A蛋白在尿路上皮癌和癌旁组织中表达量分别为(4.23±0.68)､(2.18±0.57),在尿路上皮癌组织中JAM-A蛋白含量高于癌旁组织,差异有高度统计学意义(P<0.001),见图2｡

图2Western-blot方法检测尿路上皮癌和癌旁组织中JAM-A蛋白表达

2.3JAM-A蛋白表达及临床病理指标的相关性JAM-A蛋白表达量与尿路上皮癌浸润､淋巴结转移相关(P=0.001､P<0.001),而与性别､年龄､慢性炎症均无显著相关性(P>0.05),见表1｡

表1JAM-A水平与尿路上皮癌临床病理参数关系分析[n(%),(x±s),n=119]

2.4不同JAM-A蛋白表达水平与临床病理指标的相关性相对于JAM-A蛋白低表达而言,JAM-A蛋白高表达与尿路上皮癌浸润､淋巴结转移呈正相关(P=0.001､P=0.034),而与性别､年龄､慢性炎症无显著相关性(P>0.05),见表2｡

表2不同JAM-A蛋白表达水平与尿路上皮癌临床病理关系分析[n(%)]

2.5ROC曲线分析JAM-A在尿路上皮癌病理诊断中AUC值为0.878,95%CI:0.845,0.923,灵敏度为6.4%､特异度为85%,说明JAM-A蛋白表达水平在尿路上皮癌病理诊断中具有诊断价值,见图3｡

图3JAM-A对尿路上皮癌诊断ROC曲线分析

3、讨论

尿路上皮癌是一种起源于尿路被覆上皮常见的泌尿系统恶性肿瘤之一,临床上尿路上皮癌患者面临易复发､治疗手段有限及晚期预后较差等问题,首选的治疗方法是含铂类药物的联合化疗方案,其总体反应率为50%左右,由于化疗药物敏感性下降等原因,所有患者均接受≥3个周期化疗,并且在最后一次化疗后100d内进行手术或接受化疗期间出现疾病进展[9]｡对于疾病进展的患者,进一步治疗有效的方法非常有限,使临床迫切寻求其他有效的治疗手段｡因此,亟需探讨一种新的特异性较高的辅助诊断和判断预后的标志物｡

JAM-A是报道较多的一种具有多种生理功能的跨膜免疫球蛋白超家族成员之一,主要在上皮细胞和内皮细胞的紧密连接处表达,可以通过血小板活化､白细胞迁移､血管生成和细胞凋亡等途径参与人体细胞的正常生理过程,也可以在肿瘤细胞间的黏附､浸润､迁移中发挥非常重要的作用｡目前研究报道JAM-A蛋白表达在不同肿瘤中的作用不一致,少部分研究表明JAM-A低表达可以促进某些肿瘤细胞例如胃癌､肾透明细胞癌和乳腺癌及胰腺癌等的进展,而且其降低程度与肿瘤的恶性程度和转移相关[10-13];而多数研究报道相反,他们发现JAM-A在胶质瘤､鼻咽癌､胃癌､非小细胞肺癌中高表达,可以促进肿瘤细胞的增殖,与肿瘤侵袭性和不良预后呈正相关[14-15]｡本研究发现,无论是免疫组化SP法还是WB方法结果均显示在尿路上皮癌中JAM-A蛋白表达显著高于癌旁组织,这与大多数的研究报道相一致[16-17],表明在尿路上皮癌中JAM-A蛋白阳性表达是常见的分子事件,而且进一步的ROC曲线结果显示JAM-A蛋白表达灵敏度为66.4%,特异度为85%,在尿路上皮癌中存在病理诊断的意义｡

关于JAM-A高表达还是低表达具有促癌作用,研究报道一直存在争议,有研究结果[10-13]显示,JAM-A低表达可以促进恶性肿瘤的进展,和肿瘤的侵袭和转移相关,重点强调了JAM-A蛋白具有维持细胞之间连接和黏附的功能,黏附功能下降或丧失导致细胞松散,脱离连接,之后才有发生侵袭和转移的可能,因此认为紧密连接黏膜分子家族的主要功能就是阻止癌细胞转移｡而这只是JAM-A蛋白的功能之一,而且发生在特定的微环境下激活了与黏附相关的细胞内信号通路来抑制肿瘤进展和转移,这与其结构相关,JAM-A蛋白有3个重要的分子结构[18],即两个胞外免疫球蛋白样的结构域,跨膜区和胞内尾部;胞内尾部既可以直接和细胞骨架蛋白相连,也可以发生不同程度的磷酸化,而胞外结构域可以形成同源或异源二聚体(顺式或反式),已经被研究证实和细胞黏附功能相关,同时也包含一个已知的n-糖基化位点(N185),可以被修饰,JAM-A蛋白经过翻译后被修饰就可以调节JAM-A的功能｡这些不同的分子结构介导不同的分子信号通路,在肿瘤细胞的增殖､侵袭､细胞迁移､转移等过程中发挥作用｡JAM-A蛋白高表达通过激活与黏附无关的细胞内信号通路来驱动肿瘤发生并促进转移,比如XiongR等人[4]发现在食管鳞状细胞癌中上调JAM-A并通过NF-κB信号通路发挥致癌特性,而MagaraK等人[3]发现在乳腺癌中JAM-A通过调节氨基酸转运蛋白LAT1促进乳腺癌进展,还有研究报道[15]鼻咽癌中JAM-A上调通过激活磷酸肌苷3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路发生EMT(上皮间质转化),导致JAM-A高表达和转移及预后不良正相关｡这些研究均报道JAM-A高表达能够促进肿瘤细胞的增殖､侵袭､迁移和转移,这与本研究结果一致｡本研究结果显示在尿路上皮癌中JAM-A高表达与浸润和转移呈正相关,即尿路上皮癌中JAM-A高表达比低表达更容易发生浸润和转移,具有更高的恶性程度,JAM-A有可能成为提示尿路上皮癌不良预后潜在的分子标志物,有待于进一步研究｡

本研究发现JAM-A能够协助诊断尿路上皮癌,而且JAM-A高表达更易发生浸润和转移,说明JAM-A在膀胱肿瘤研究中具有重要价值｡但是本研究存在一定的局限性｡首先,在膀胱尿路上皮癌中的JAM-A发挥作用的具体作用机制尚不清楚,其次JAM-A对膀胱癌患者提示不良预后可能需要大量的临床样本检验｡本研究探索了JAM-A在膀胱尿路上皮癌中的作用,为尿路上皮癌诊断标志物的筛选提供了理论依据｡

参考文献:

[8]应建明,郭军,中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会.中国尿路上皮癌人表皮生长因子受体2检测临床病理专家共识[J].中华肿瘤杂志,2021,43(10):1-6.

[9]何旺,黄海.2022ASCO-GU尿路上皮癌精粹解析[J].中华泌尿外科杂志,2022,43(4):245-248.

基金资助:内蒙古自治区包头市卫生健康科技计划项目资金资助(wsjkkj2022112);

文章来源:赵英芳,隋贵春,王凤娇,等.膀胱尿路上皮癌中连接黏附分子A蛋白表达及临床意义[J].中国疗养医学,2025,34(03):102-106.