癌症进展是由于遗传信息的改变而导致癌细胞不受控制的扩散，涉及多个独立的分子改变的积累，相应地会形成调控遗传信息改变的信号通路轴，这些致癌信号通路状态决定了癌症的生物学行为、免疫反应和预后意义[1]。然而，癌症进展同时伴随着形态学的改变，可被CT、MRI或PET/CT等影像发现，为非侵入性手段。放射组学是突破视觉局限，更多旨在揭露影像蕴含的深层次，甚至与分子相关密切信息的人工智能(AI)技术。本研究拟通过匹配的癌症基因组图谱(TCGA)/癌症成像档案馆(TCIA)数据库分析基于非侵入性的CT放射组学预测膀胱癌(BLCA)经典致癌信号通路状态改变的价值，促进放射组学在分子领域评估中的应用。

1、资料与方法

1.1 一般资料

107例BLCA患者的CT影像自TCIA中下载。BLCA的P13K、RTK RAS、NOTCH以及TP53经典致癌信号通路改变图由TCGA泛癌分析项目中获取，该项目利用BLCA基因的突变、拷贝数变异、融合和DNA甲基化等，分析了经典致癌信号通路的改变状态，并整合成二元分类图谱：(阳性，+)/(阴性，-)[2]。由两位具有5年腹部诊断经验的放射医师以纳入标准进一步筛选影像-经典致癌信号通路队列：(1)病理证实为BLCA患者；(2)具有匹配的术前增强CT影像和经典致癌信号通路二元改变图谱。排除标准：(1)术后BLCA影像；(2)增强CT影像存在伪影干扰或成像不清或无法定位病灶；(3)单一缺乏增强CT影像或信号通路二元改变图。共有69例BLCA患者纳入影像-经典致癌通路研究队列，均为浸润性BLCA,年龄51～87岁，平均(68.71±9.73)岁，其中男53例，女16例；美国癌症联合会(AJCC)临床分期Ⅱ级25例，Ⅲ级22例和Ⅳ级22例；病理分级均为高级别。

1.2 CT影像预处理和分割

69例BLCA患者术前均接受了盆腔增强CT扫描，CT扫描仪包括Toshiba Medical Systems、Philips Healthcare、GE Healthcare和Siemens Healthineers, 扫描参数：管电压100～140 kV;管电流95～795 mA;矩阵大小为512×512;切片厚度为≤5 mm[3]。BLCA病灶在动脉期中明显高于膀胱壁，可显示肿瘤边界。增强CT影像导入3D slicer图像分割软件中[4],并由两位具有5年腹部诊断经验的放射医师在动脉期中逐层勾画感兴趣区(regions of interest, ROI),对于边界分歧将由第三位具有8年腹部诊断经验的放射医师进行裁决，提高分割精度(图1A、B)。由于CT扫描参数和设备之间的差异，将所有图像的体素重新采样为1 mm×1 mm×1 mm, 提高放射组学特征间的辨别。基于3D slicer软件中PyRadiomics模块提取放射组学特征，其基于Python环境下开发：高通或低通小波滤波器、具有不同λ参数(λ= 0.5、1.0和1.5)的高斯滤波器和基于小波的过程用于预处理，固定bin宽度设置为25 HU以离散体素强度值，提取的放射组学特征包括一阶特征、灰度共生矩阵、灰度游程矩阵、灰度级大小区域矩阵、灰度依赖矩阵、邻域灰度差矩阵和高阶特征，共1130个特征，描述BLCA的形态学特征[5](图1C)。

1.3 预测经典致癌信号通路状态的CT放射组学评分开发与验证

依据经典致癌信号通路二元状态图谱，将69例BLCA患者随机分为训练队列(n=55)和验证队列(n=14),并进一步采用Z-score标准化方法对特征归一化处理，去除在所有患者中相同取值的特征，提高运算效率。为降低特征维数，过滤掉冗余特征，在训练队列中引入统计检验：t检验和Mann-Whitney U秩和检验，依据特征偏态与否采用上述检验，从1130个特征中筛选信号通路状态(+/-)具有显著统计学意义的特征，设置P<0.03。最小绝对收缩和选择算子回归算法(least absolute shrinkage and selection operator, LASSO)用于最终降维，保留了最重要和最佳可重复性的特征，并通过广义线性模型计算每个特征的系数(图1D、E)。通过特征及其相应系数的加权线性组合计算每例BLCA患者的放射组学评分。验证队列以相同的系数权重计算放射组学评分，验证评分的鲁棒性。受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve, ROC)用于评估放射组学评分的性能，Hosmer-Lemeshow检验用于校准放射组学评分预测与实际情况的一致性，P>0.05表示具有良好的一致性。

1.4 统计学分析

采用SPSS(17.0版本)和 R语言(3.62版本)软件用于分析和作图。计数资料以例数(%)表示。共线性诊断分析放射组学特征间的共线性关系，以方差膨胀因子(variance inflation factor, VIF)>10为标准说明特征间具有共线性关系。单因素分析放射组学评分与经典致癌信号通路改变的风险，并以比值比(odds ratio, OR)表示。不同的致癌信号通路间存在相互协同或互斥作用，Pearson相关系数用于分析不同致癌信号通路改变状态的相关关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 经典致癌信号通路二元状态图谱

本研究共纳入4条经典致癌信号通路：P13K、RTK RAS、NOTCH以及TP53,其中P13K(+)35例(50.72%),P13K(-)34例(49.28%);RTK RAS(+)43例(62.32%),RTK RAS(-)26例(37.68%);NOTCH(+)29例(42.03%),NOTCH(-)40例(57.97%);TP53(+)45例(65.22%),TP53(-)24例(34.78%)。不难看出，每条信号通路状态改变的阳性比率均大于40%,其中TP53信号通路改变最明显。

表1 开发BLCA经典致癌信号通路的放射组学评分的特征及相应权重系数

表2 放射组学评分预测BLCA经典致癌信号通路状态的性能汇总

2.2 预测经典致癌信号通路状态的CT放射组学评分开发与验证

依据统计检验筛选P<0.03的显著性特征，分别筛选出P13K(+)、RTK RAS(+)、NOTCH(+)以及TP53(+)显著相关的特征个数为18,17,9和22,进一步呈交给LASSO进行最终选择，分别由7,4,5和7个特征开发CT放射组学评分，每个特征的系数权重见表1。通过共线性诊断发现，每条通路的特征间均无共线性关系，VIF均<5,可用于放射组学评分的开发。在致癌信号通路改变状态的预测中，训练队列和验证队列均表现为中度以上性能，训练队列的P13K(+)、RTK RAS(+)、NOTCH(+)以及TP53(+)的曲线下面积(AUC)分别为0.77(95%CI:0.63～0.87),0.83(95%CI:0.71～0.92),0.81(95%CI:0.68～0.91),0.92(95%CI:0.82～0.98);验证队列的AUC分别为0.82(95%CI:0.53～0.97),0.73(95%CI:0.44～0.93),0.71(95%CI:0.41～0.91),0.71(95%CI:0.42～0.91)。Hosmer-Lemeshow检验P值分别为0.19,0.73,0.73,0.98,均>0.05,表现了训练队列放射组学评分预测与实际情况具有良好的一致性效果。

在训练队列+验证队列(总队列)中，P13K、RTK RAS、NOTCH以及TP53预测致癌信号通路状态改变的AUC值达到了中高度预测效果，分别为0.79(95%CI:0.67～0.88),0.81(95%CI:0.70～0.90),0.79(95%CI:0.68～0.88),0.88(95%CI:0.78～0.95),汇总结果见表2,不难发现，预测敏感度均很高，特别是P13K,敏感度达到了0.91,而特异度适中，TP53特异度最优，为0.83。Hosmer-Lemeshow检验P值分别为0.48,0.67,0.36,0.87,均>0.05,表现了良好的一致性效果。通过单因素分析了放射组学评分与致癌信号通路状态改变的风险关系，发现了放射组学评分均为致癌信号通路状态改变的高风险预测因子，OR值分别为3.03(P<0.01),50.44(P<0.01),1.93(P=0.24),7.29(P<0.01),遗憾的是与NOTCH(+)的关系并无统计学意义。通过Pearson相关系数，进一步分析了不同信号通路间的相互关系，发现NOTCH与RTK RAS存在正相关关系(r=0.41,P<0.001),另与P13K存在负相关关系(r=-0.60,P<0.001)(图1F)。在临床分期(Ⅱ/Ⅲ vs Ⅳ)中，RTK RAS(P=0.03)与TP53(P<0.05)放射组学评分在不同临床分期具有统计学意义(t检验)。

图1 A～F开发放射组学评分的重要步骤汇总。  

3、讨论

非侵入性获取分子/信号通路的表达/状态对于临床管理和策略制定具有很重要的指导意义，也是迈向精准医学的关键挑战。本研究通过TCGA/TCIA开源数据库开发了一种CT放射组学评分用于尝试性预测经典致癌信号通路状态图谱，性能达到了中度以上效果，特别是在TP53(+)预测中，AUC值达到了0.88,对比同类型研究预测性能效果略低，例如基于CT放射组学评分预测头颈癌6种不同致癌信号通路状态均达到了高度性能[6]。但仍不可忽略作为少有的综合分析放射组学在BLCA致癌信号通路状态预测的临床价值。

BLCA的演进过程主要从原位癌向肌层甚至向周围组织侵犯播散，主要是分子遗传信息的改变导致的结果，其通过致癌信号通路调控肿瘤的演进过程，致癌信号通路在其发生、侵犯、转移、血管生成、治疗响应等生物学方面发挥着重要的信号传导角色，多种经典信号通路已被确定为在癌症中经常发生基因改变，例如TEAD4作为BLCA的预后不良标志物发挥作用，通过PI3K/AKT信号通路调节上皮间质转化介导其转移[7];MiR-9小RNA通过NOTCH信号通路促进BLCA细胞增殖并抑制其凋亡[8];靶向TP53与mTOR信号通路的结合可作为潜在方法抑制BLCA的侵袭性生长[9]。TCGA作为目前最大样本的共享资源库，以往的研究已经逐步绘制出多种致癌信号通路状态的改变图谱[10],Sanchez-Vega等[2]人以肿瘤的突变、拷贝数变化、mRNA表达、基因融合和DNA 甲基化等，分析了10个经典信号通路中体细胞改变的机制和模式：Cell cycle, HIPPO,MYC,NOTCH,NRF2,P13K/AKT,RTK-RAS,TGFβ,TP53和β-catenin/Wnt。本研究主要依据上述研究整理的经典致癌信号通路状态二元分类图谱进行尝试预测，纳入P13K、RTK RAS、NOTCH和TP53四条信号通路，通路状态改变阳性率均大于40%,且RTK RAS与TP53放射组学评分在不同临床分期分布不同，代表癌症演进伴随着宏观和微观的变化。

放射组学是采用计算机辅助量化医学图像中携带的肿瘤生物学相关信息，对比视觉观察，更旨在剖析图像隐藏的更深层次，甚至达到分子相关的信息[11]。放射组学已经表现出比视觉观察更有效挖掘肿瘤的生物学特性，例如源于530例子宫内膜癌的MRI深度学习网络模型表现出略高于放射医师视觉观察效果(敏感度：0.67 vs. 0.61;特异度：0.88 vs. 0.81)[12],特别是在分子领域的非侵入性评估更是让人期待，例如基于183例肺腺癌的术前非增强CT放射特征开发的放射组学评分预测表皮生长因子受体(EGFR)的个体化突变，训练队列的AUC值为0.80,敏感度为0.78[13];多种关键信号通路驱动了MRI影像携带的放射组学表型改变，涉及胶质母细胞瘤的免疫响应、肿瘤侵袭[14]。在上述研究背景下，针对BLCA放射组学研究进行国内外研究现状调研，其在分子领域的应用需要更多的研究来剖析，缺乏放射组学与经典致癌信号通路的综合分析，本研究基于此情况下开展。放射组学质量评分(RQS)衡量AI研究方法学质量的重要工具，包括16项评价指标，包括AI研究中的图像采集、图像预处理、特征处理、模型构建和评价、数据披露和临床收益等过程，评分范围处于-8～36[15],本研究基于RQS工具，评分约为10分，处于偏低方法学质量研究。本研究经过LASSO回归筛选最优放射组学特征子集开发放射组学评分，开发特征均小于10个，所有特征为9个一阶特征、5个灰度共生矩阵、7个灰度级大小区域矩阵、3个灰度依赖矩阵，均为小波和高斯滤波器转换的特征，代表肿瘤不同的纹理和强度特征，反映了致癌信号通路状态改变与否的肿瘤异质性。“firstorder_Skewness”反映图像量化特征数值分布对平均值的不对称性，即内部分布的均匀性。“gldm_DependenceNonUniformityNormalized”反映图像的相似性，值越低代表相关性的同质性越高，即可理解为反映BLCA与周围组织的相似性。“glszm_GrayLevelNonUniformityNormalized”反映测量图像中灰度级强度值的变化，数值越低表示强度值的相似度越高，即是同质性。“glszm_ZoneVariance”反映区域体积变化差异。上述4个特征均在2条以上致癌信号通路中参与放射组学评分开发，特别是“firstorder_Skewness”特征。基于最优特征子集开发的放射组学评分在训练队列和验证队列中均表现为中度以上预测性能，对比相似型研究效果略低，但本研究样本量远低于相似研究，这结果被认为是可以接受。此外，放射组学评分均为致癌信号通路状态改变的高危因素，特别是在RTK RAS通路，OR达到了50.44,遗憾地是NOTCH通路并不存在统计学意义。最后，不同的致癌信号通路在调控过程中存在共存协同和互斥模式[9],本研究发现NOTCH的放射组学评分与RTK RAS存在正相关关系，与P13K存在负相关关系，这与分子领域发现有一定的相似性。

本研究存在放射组学研究常见的局限性：(1)样本量小，评分的普适性未得到验证，仍需更多的多中心前瞻性研究验证。(2)手工分割图像的主观性，仍需要更多不同层次经验的放射医师多次反复或采用全自动分割技术。(3)放射组学特征与致癌信号通路状态的关系并无直接的因果验证，仍需细胞和动物水平实验的验证。

综上所述，本研究初步表明放射组学具有无创性预测BLCA经典致癌信号通路状态的价值，为肿瘤的靶向治疗疗效监测提供潜在的非侵入性手段。但放射组学与致癌信号通路状态的因果关系仍有赖于未来的研究阐明。

参考文献:

[4]蒋雨,黄小华,秦石泽,等.基于增强MRI影像组学模型预测HIFU消融子宫肌瘤疗效的价值研究 [J].临床放射学杂志,2022,41:2095-2100.

[11]吴林永,唐业欢,李晴,等.放射基因组学分析头颈部鳞状细胞癌成像特征与免疫亚型的关系 [J].临床放射学杂志,2021,40:2074-2078.

[13]李淑华,杨昭,王小雷,等.基于CT影像组学列线图预测肺腺癌EGFR突变的研究 [J].临床放射学杂志,2022,41:1676-1682.

文章来源:刘文慈,何学军,谭志等.基于TCGA/TCIA的CT放射组学预测膀胱癌经典致癌信号通路的状态[J].临床放射学杂志,2024,43(02):242-246.