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微小RNA-103a和脑源性神经营养因子在子痫前期孕妇血清中的表达及作用

2023-10-27 56 上传者：管理员

摘要：目的检测子痫前期孕妇血清微小RNA-103a(miR-103a)、脑源性神经营养因子(BDNF)的表达情况，探讨二者在子痫前期中的作用及关系。方法选取2018年9月—2020年12月浙江省台州医院收治的102例子痫前期孕妇为研究对象(研究组),其中重度子痫前期30例(重度组),轻度子痫前期72例(轻度组),另选取同期分娩的健康孕妇50例作为对照组。采用荧光定量PCR技术检测血清miR-103a水平，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清BDNF水平。比较研究组和对照组孕妇血清miR-103a、BDNF水平，采用Pearson法分析子痫前期患者血清miR-103a、BDNF表达水平的相关性；采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清miR-103a、BDNF对子痫前期的诊断价值。结果研究组血清miR-103a、BDNF水平分别为(1.24±0.26)和(21.86±5.21)pg/ml,对照组血清miR-103a、BDNF水平分别为(0.91±0.11)和(32.87±7.93)pg/ml,研究组血清miR-103a水平明显高于对照组，BDNF水平明显低于对照组，差异均有统计学意义(t=8.594,10.236,均P<0.05)。重度组子痫前期患者血清miR-103a、BDNF水平分别为(1.57±0.32)和(17.25±4.57)pg/ml,轻度组子痫前期患者血清miR-103a、BDNF水平分别为(1.08±0.20)和(23.84±5.36)pg/ml,重度组子痫前期患者血清miR-103a水平较轻度组明显升高，BDNF水平较轻度组明显降低，差异均有统计学意义(t=9.355,5.896,均P<0.05)。子痫前期孕妇血清miR-103a、BDNF水平呈负相关(r=-0.647,P<0.05),血清miR-103a与BDNF 3’UTR存在两段靶向结合区。血清miR-103a和BDNF联合诊断时，约登指数为0.783,灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为86.27%、92.00%、95.65%、64.79%。血清miR-103a、BDNF单独诊断子痫前期的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.900(95%CI:0.841～0.943)、0.868(95%CI:0.804～0.917),二者联合诊断子痫前期的AUC为0.947(95%CI:0.899～0.977),高于各自单独诊断(Z=2.399,2.945,均P<0.05)。结论子痫前期孕妇血清miR-103a表达升高，BDNF表达降低，与病情严重程度有关，可作为提示子痫前期发生和发展的潜在生物指标。

关键词：
妊娠期特发高血压疾病
子痫前期
微小RNA-103a
相关性
脑源性神经营养因子
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子痫前期是一种妊娠期特发高血压疾病，严重时孕妇可发生头痛、视力模糊、痉挛等症状，其发病机制尚未完全阐明。临床根据子痫前期患者的表现和生化指标分为重度子痫前期和轻度子痫前期，重度子痫前期患者可能发生多器官损伤，如肾、心、脑等[1]。微小RNA-103a(miR-103a)是非编码RNA中的一员，miR-103a-3p在帕金森病中通过Parkin/自噬相关基因Ambra-1介导线粒体吞噬通路调节参与神经元损伤的致病机制[2],提示miR-103a-3p可能对人脑神经元产生作用。脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子(NTs)家族一员，在中枢神经系统中起关键作用，如促进突触可塑性、神经发育及神经保护[3,4]。中枢神经系统完善对胎儿智力发育、成长等具有重要作用，已有研究[5]发现BDNF在正常孕妇及子痫前期孕妇胎盘不同区域mRNA表达水平不同，而BDNF在正常孕妇及子痫前期孕妇血清中的表达情况鲜见报道。因此，本研究通过检测子痫前期孕妇血清miR-103a、BDNF水平，分析其表达以及在子痫前期中的作用。

1、资料与方法

1.1资料来源

选取2018年9月—2020年12月浙江省台州医院收治的子痫前期孕妇102例为研究组，其中重度子痫前期30例(重度组),轻度子痫前期72例(轻度组),另选取同期分娩的健康孕妇50例作为对照组。纳入标准：①子痫前期孕妇的诊断及分组均符合中华医学会心血管病学分会高血压学组发布的《妊娠期高血压疾病血压管理专家共识(2019)》[6]中相关诊断标准；②单胎妊娠；③对照组均未合并其他内、外科疾病；④所有入组对象均知情同意并配合检查及相关资料收集。排除标准：①合并心血管疾病者；②合并心、肝、肾功能异常者；③合并恶性肿瘤或免疫系统疾病者；④存在意识、语言、精神障碍等无法配合完成研究者。本研究获得浙江省台州医院伦理委员会批准通过。

1.2方法

1.2.1数据库检索

利用TargetScanHuman 7.2数据库(http: //www.targetscan.org/vert_72/)检索目标蛋白BDNF与miR-103a的潜在靶向关系。

1.2.2血样采集与检测

所有子痫前期孕妇入院后次日清晨取空腹静脉血4 ml,健康孕妇取空腹8 h静脉血4 ml,均分置于两个干净EP管中，2 000 r/min离心15 min(离心半径8 cm),收集上层清液置于-20℃保存，采用酶联免疫吸附试验检测血清BDNF水平，人BDNF试剂盒购自武汉益普生物科技有限公司，由同人、同批次严格按照试剂盒说明书步骤方法进行检测，取均值。

1.2.3血清miR-103a水平检测

采用荧光定量PCR技术检测血清miR-103a水平。首先利用Trizol试剂盒(美国R&D公司)提取血清总RNA,注意防止RNA酶污染。利用紫外可见分光光度计检测RNA纯度，OD260/OD280在1.8～2.2之间提示纯度较好。利用反转录试剂盒(美国ThermoFisher公司)合成cDNA,利用MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix试剂(美国ThermoScientific公司)进行PCR扩增，miR-103a以U6为内参基因。反应条件：95℃预变性10 min; 95℃延伸15 s; 60℃退火60 s,共40个循环。血清miR-103a上游引物：5'-TCAATGCCTTCATAGCCCTGT-3',下游引物：5'-TTACAGTGCTGCCTTGCCTTGTTGC-3';U6上游引物：5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3',下游引物：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。用2-ΔΔCt法计算miR-103a相对表达量。

1.2.4观察指标

收集并比较所有入组孕妇的一般资料如年龄、孕前体质量指数(BMI)、孕周、孕次、24 h尿蛋白水平及血清miR-103a、BDNF水平。

1.3统计学分析

利用SPSS 25.0统计学软件进行数据录入与分析，符合正态分布的计量资料以(x¯±s)表示，两组间比较采用t检验，3组数据比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。采用Pearson法分析子痫前期孕妇血清miR-103a、BDNF水平的相关性。利用受试者工作特征(ROC)曲线评价血清miR-103a、BDNF水平对子痫前期的诊断价值，利用二元logistic回归模型分析单独诊断与联合诊断的特异度、灵敏度、阳性预测值、阴性预测值。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 3组研究对象一般资料比较

3组孕妇的年龄、孕前BMI、孕次比较差异均无统计学意义(均P>0.05),孕周、24 h尿蛋白水平比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。重度组孕妇的孕周明显小于轻度组、对照组，轻度组孕妇的孕周明显小于对照组；重度组孕妇的24 h尿蛋白水平明显高于轻度组、对照组，轻度组孕妇的24 h尿蛋白水平明显高于对照组。见表1。

表1 3组研究对象一般资料比较(x¯±s)

2.2研究组和对照组血清miR-103a、BDNF水平比较

研究组血清miR-103a水平明显高于对照组，BDNF水平明显低于对照组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。研究组和对照组血清miR-103a、BDNF水平比较见表2。

2.3重度组和轻度组子痫前期患者血清miR-103a、BDNF水平比较

重度组子痫前期患者血清miR-103a水平较轻度组明显升高，BDNF水平较轻度组明显降低，差异均具有统计学意义(均P<0.05)。见表3。

表2研究组和对照组血清miR-103a、BDNF水平比较(x¯±s)

表3重度组和轻度组子痫前期患者血清miR-103a、BDNF水平比较(x¯±s)

2.4子痫前期孕妇血清miR-103a、BDNF水平的相关性

子痫前期孕妇血清miR-103a、BDNF水平呈负相关(r=-0.647,P<0.05),见图1。利用TargetScanHuman 7.2检索可知，血清miR-103a与BDNF 3'UTR存在两段靶向结合区，见图2。

图1子痫前期孕妇血清miR-103a、BDNF水平的相关性

图2 TargetScan数据库中检索miR-103a与BDNF 3'UTR端的靶向结合区

2.5血清miR-103a、BDNF对子痫前期的诊断价值

以血清miR-103a水平1.07为最佳截断值时，约登指数为0.744,灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为80.39%、94.00%、96.47%、70.15%;以血清BDNF水平26.92 pg/ml为最佳截断值时，约登指数为0.642,灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为88.24%、76.00%、88.24%、76.00%;二者联合诊断时，约登指数为0.783,灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为86.27%、92.00%、95.65%、64.79%。血清miR-103a、BDNF单独诊断子痫前期的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.900(95%CI:0.841～0.943)、0.868(95%CI:0.804～0.917),二者联合诊断子痫前期的AUC为0.947(95%CI:0.899～0.977),高于各自单独诊断(Z=2.399,2.945,均P<0.05)。血清miR-103a、BDNF单独及联合诊断子痫前期的ROC曲线见图3。

图3血清miR-103a、BDNF单独及联合诊断子痫前期的ROC曲线

3、讨论

研究[7,8]发现：miRNAs具有潜在的基因调节功能。成熟的miRNAs可以通过与靶基因mRNA的3'UTR结合，特异性地抑制靶基因mRNA的翻译或促进其降解，从而在转录后水平调控基因的表达，这种调节在神经发育分化、细胞增殖和凋亡、肿瘤形成中起着重要作用[9,10]。miRNAs由细胞分泌，易在血清中被检测到，可以作为子痫前期早期诊断或潜在靶向研究的有效生物标志物。早期研究[11]已证实妊娠期相关并发症与miRNAs表达异常有关，但miR-103a在子痫前期中的研究报道较少。本研究结果显示：与对照组孕妇相比，子痫前期孕妇血清miR-103a水平上升，且重度子痫前期孕妇血清miR-103a水平高于轻度组，表明miR-103a水平异常升高与子痫前期孕妇病情严重程度有关。国内学者[12]研究发现：miR-103a在精神分裂症患者外周血中表达上调，BDNF表达下调，二者之间呈负相关，可能通过干扰神经生物功能，引发神经系统紊乱，促使疾病发生。另有研究[13]发现：癫痫大鼠海马组织中miR-103a水平升高，BDNF水平降低；利用miR-103a抑制剂干预后，miR-103a表达降低，BDNF表达增加，凋亡神经元数量减少，存活神经元数量增多，进一步实验证实抑制miR-103a可通过调节BDNF基因抑制癫痫大鼠海马组织星形胶质细胞的活化，改善癫痫大鼠神经元的病理损伤。以上研究表明miR-103a与BDNF可能存在靶向关系，参与机体神经系统发育，保护神经元。

人类BDNF基因由11个外显子组成，其保守结构决定了生理功能在很大程度上独立于系统发育阶段，BDNF存在于几乎所有大脑区域，其功能决定于大脑发育阶段及脑组织神经元、胶质或血管成分[14]。BDNF发挥多种生理功能，包括参与发育过程，调节神经、胶质细胞和突触发生，神经保护，控制突触相互作用，影响记忆和认知机制[15]。梁美丽等[16]研究显示：子痫前期孕妇预后不良组血清BDNF水平低于预后良好组，且对新生儿预后具有积极的诊断价值，与本研究结果一致。本研究结果显示：与对照组正常孕妇相比，子痫前期孕妇血清BDNF水平下降，且重度子痫前期孕妇血清BDNF水平低于轻度组，分析其原因可能为子痫前期孕妇受免疫失调、炎症反应、氧化/抗氧化机制缺陷、内源性ω-3脂肪酸水平降低等影响，BDNF水平异常降低，可能干扰血管生成、胎盘发育及胎儿生长[17],提示BDNF可能参与子痫前期发病及预后不良机制。本研究还发现：子痫前期孕妇血清miR-103a与BDNF水平呈负相关，进一步利用TargetScan数据库检索发现miR-103a与BDNF 3'UTR端存在两段靶向结合区(位置分别为299～305和2 080～2 086),表明miR-103a与BDNF存在靶向调控作用，参与子痫前期发生、发展，具体作用方式还需要细胞实验研究。本研究利用ROC曲线评估血清miR-103a、BDNF对子痫前期发生的诊断价值，结果显示血清miR-103a、BDNF诊断子痫前期的AUC分别为0.900、0.868,二者联合诊断子痫前期的AUC为0.947,明显高于单独诊断，表明血清miR-103a与BDNF对子痫前期均有较高的诊断价值，联合诊断效能更好，可作为提示子痫前期发生的潜在生物指标。

综上所述，子痫前期孕妇血清miR-103a水平升高，BDNF水平降低，二者水平变化与子痫前期严重程度有关，二者之间呈负相关，miR-103a可能靶向调控BDNF表达参与子痫前期的发生、发展，具体作用方式有待深入研究。本研究为单中心研究，且未分析不同血清miR-103a、BDNF水平子痫前期患者妊娠结局的差异，后续应纳入更大样本量，结合患者妊娠结局进行更全面分析，以期为临床诊断提供依据。

参考文献:

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文章来源:孙雪梅,王锦栋,连燕飞.微小RNA-103a和脑源性神经营养因子在子痫前期孕妇血清中的表达及作用[J].中国妇幼保健,2023,38(21):4141-4144.