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黄芪多糖对三阴性乳腺癌细胞增殖和侵袭作用研究

2023-10-31 79 上传者：管理员

摘要：目的探索三阴性乳腺癌细胞应用黄芪多糖(APS)处理后，细胞增殖和侵袭能力的变化，及其对Wnt/β-catenin通路的影响。方法将BT-549细胞分为BT-549空白组(常规培养)和BT-549低、中、高剂量实验组(分别给予200、400、800μg•mL-1黄芪多糖处理);将MDA-MB-453细胞分为MDA-MB-453空白组(常规培养)和MDA-MB-453低、中、高剂量实验组(分别给予200、400、800μg•mL-1黄芪多糖处理)。以细胞计数试剂盒-8(CCK8)实验测定细胞增殖情况；以划痕实验检测细胞迁移情况；以Transwell法检测细胞侵袭情况；以蛋白质印迹法检测细胞β-连环蛋白(β-catenin)、c-myc、细胞周期素D1(Cyclin D1)蛋白表达水平。结果 BT-549细胞空白组和低、中、高剂量实验组的细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(91.24±3.61)%、(87.19±4.83)%和(84.45±2.66)%,迁移程度分别为(29.16±4.96)%、(25.69±4.14)%、(22.39±7.11)%和(11.25±1.30)%;MDA-MB-453细胞空白组和低、中、高剂量实验组的细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(99.10±4.57)%、(87.86±3.03)%和(82.58±4.60)%,迁移程度分别为(29.57±0.49)%、(22.00±5.04)%、(12.99±5.29)%和(2.95±0.20)%,中、高剂量实验组上述指标与空白组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01)。BT-549细胞空白组和低、中、高剂量实验组的侵袭细胞数分别为304.00±15.10、90.50±13.03、63.50±3.11和34.25±14.01,低、中、高剂量实验组与空白组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01)。BT-549细胞空白组和高剂量实验组β-catenin蛋白表达水平分别为1.00±0.00和0.52±0.15,c-myc蛋白表达水平分别为1.00±0.00和0.58±0.18,Cyclin D1蛋白表达水平分别为1.00±0.00和0.67±0.17,高剂量实验组上述指标与空白组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论黄芪多糖抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖和侵袭，并调控Wnt/β-catenin通路。

关键词：
三阴性乳腺癌
侵袭
增殖
治疗靶点
黄芪多糖
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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，2020年已成为女性致死率最高的肿瘤[1]。其中三阴性乳腺癌细胞雌激素、孕激素受体阴性，人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2, HER2)阴性，缺乏有效的治疗靶点，发生复发转移的可能性更高。黄芪多糖(Astragalus Polysaccharide, APS)是中药黄芪的大分子多糖类提取物。黄芪可提高巨噬细胞的吞噬功能，促进干扰素、肿瘤坏死因子等的产生，介导体液及细胞免疫[2,3]。黄芪多糖可抑制胃癌、结直肠癌等细胞的增殖、侵袭和转移[4,5]。本文旨在探索黄芪多糖对三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制。

1、材料与方法

1材料

细胞株人三阴性乳腺癌细胞BT-549、MDA-MB-453,均购自中科院上海细胞库。

药品与试剂黄芪多糖，规格：每瓶250 mg,批号：A860847,质量分数大于98%,上海麦克林生化科技股份有限公司生产；细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8, CCK-8),购自日本DoJinDo公司；β-actin、β-连环蛋白(β-catenin)、c-myc、细胞周期素D1(Cyclin D1)一抗，羊抗鼠、羊抗兔二抗，均购自美国Immunoway公司。

仪器 RT-6000酶标仪，中国深圳雷杜生命科学股份有限公司产品；DYCZ-24DN迷你双垂直电泳槽、DYCZ-40DN迷你转印电泳槽，均为中国北京市六一仪器厂产品。

2实验方法

2.1细胞培养

人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-453(L15培养基)、BT-549细胞(1640培养基)均用15%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1链霉素的完全培养基培养，在恒温培养箱中以5%CO2、37℃以及饱和湿度条件下松盖培养。

2.2细胞分组及给药方法

将BT-549细胞分为BT-549空白组(常规培养)、BT-549低、中、高剂量组(分别给予200、400、800 μg·mL-1黄芪多糖处理);将MDA-MB-453细胞分为MDA-MB-453空白组(常规培养)、MDA-MB-453低、中、高剂量组(分别给予200、400、800 μg·mL-1黄芪多糖处理)。

2.3以CCK-8法检测细胞增殖情况[6]6]

调整细胞计数4 000个/孔接种于96孔细胞板中；按上述分组方法给药，每组设3个复孔，37℃、5% CO2条件下在培养箱中培养24 h;后每孔加入10% CCK-8反应液100 μL;将培养板在培养箱内孵育4 h;用酶标仪测定在450 nm处的光密度值，计算各浓度下的细胞存活率。存活率=实验组OD/空白组OD×100%。

2.4以划痕实验测细胞的迁移能力[7]7]

将各组细胞接种于6孔板于37℃、5% CO2,培养箱中培养；待细胞融合率达70%～80%时，使用枪头沿直尺垂直用力划横线；用无菌PBS轻轻冲洗细胞3次，洗去划下的细胞；按“2.2”分组方法加入含有不同浓度药物的无血清培养液进行培养，分别在0、6、24 h同一视野拍照。

2.5以Transwell法检测细胞的侵袭能力[7]7]

将BT-549细胞各组细胞(1640培养基，细胞浓度为2×105 mL-1)接种于预设基质胶的Transwell小室，含血清和不同剂量黄芪多糖的培养基置于下室37℃、5% CO2孵育箱内孵育24 h,取出小室，0.1%结晶紫染液染色，荧光倒置显微镜计穿膜细胞数、拍照。

2.6以蛋白印迹法检测相关通路蛋白的表达情况[6]6]

取BT-549细胞的空白组和高剂量实验组细胞，调整细胞计数至2×106个，接种至6 cm培养皿中培养24 h,加入RIPA裂解液200 μL对各组细胞进行裂解，取50 μg进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，120 V电泳稳定1.5 h,湿转至PVDF膜，300 mA转膜稳流1.5 h, 10%脱脂牛奶室温封闭2 h, β-catenin、c-myc、Cyclin D1一抗孵育过夜，浓度分别为1∶5 000,1∶2 000和1∶1 000,二抗室温孵育2 h,浓度为1∶5 000,化学发光仪对条带进行曝光显影。以β-actin为内参计算相对表达水平。

3统计学处理

用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料用x¯±sx¯±s表示，2组间比较用独立样本t检验。

2、结果

1黄芪多糖对三阴性乳腺癌细胞增殖的影响

将BT-549细胞分为BT-549空白组(常规培养)、BT-549低、中、高剂量实验组(分别给予200、400、800 μg·mL-1黄芪多糖处理);将MDA-MB-453细胞分为MDA-MB-453空白组(常规培养)、MDA-MB-453低、中、高剂量实验组(分别给予200、400、800 μg·mL-1黄芪多糖处理)。

BT-549空白组、BT-549低、中、高剂量组的细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(91.24±3.61)%、(87.19±4.83)%和(84.45±2.66)%,低、中、高剂量组与空白组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01);MDA-MB-453空白组、MDA-MB-453低、中、高剂量组的细胞存活率分别为(100.00±0.00)%、(99.10±4.57)%、(87.86±3.03)%和(82.58±4.60)%,中、高剂量组与空白组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01)。

2黄芪多糖对三阴性乳腺癌细胞迁移的影响

2种乳腺癌细胞的低、中、高剂量实验组与空白组比较，迁移速度均减慢，差异均有统计学意义(均P<0.01),结果见表1、图1。

表1 不同浓度黄芪多糖处理BT-549和MDA-MB-453细胞6、24 h后的迁移情况(x¯±s)(x¯±s)

3黄芪多糖对三阴性乳腺癌细胞侵袭的影响

经不同浓度黄芪多糖处理BT-549细胞后，BT-549空白组和BT-549低、中、高剂量实验组的侵袭细胞数分别为304.00±15.10、90.50±13.03、63.50±3.11和34.25±14.01,各剂量实验组与空白组比较，差异均有统计学意义(均P<0.01),见图2。说明黄芪多糖能够有效抑制三阴性乳腺癌细胞侵袭。

4黄芪多糖参与乳腺癌Wnt/β-catenin通路的调控

如表2所示，BT-549细胞高剂量实验组与空白组比较，β-catenin、c-myc、Cyclin D1蛋白相对表达水平均显著下降，差异均有统计学意义(均P<0.01)。

表2 应用APS对BT-549细胞中β-catenin、c-myc和Cyclin D1蛋白表达水平影响(x¯±s)(x¯±s)

3、讨论

本研究发现黄芪多糖可以抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，并且抑制Wnt/β-catenin信号通路下游蛋白表达，提示黄芪多糖可能通过下调Wnt/β-catenin信号通路抑制三阴性乳腺癌细胞增殖。

脊椎动物中Wnt信号广泛存在且高度保守，主要参与胚胎的早期发育、组织再生等生理活动[8]。在肿瘤的发生发展中，Wnt通路的异常活化，可能诱导下游转录子激活，从而诱导癌症发生[9]。乳腺癌中Wnt/β-catenin信号通路也存在异常激活的情况，张团结等[10]研究发现，乳腺癌中β-catenin表达异常升高，且其表达与肿瘤恶性状态密切相关。β-catenin、c-myc、Cyclin D1是经典Wnt/β-catenin通路的下游关键蛋白，是肿瘤增殖过程中的重要蛋白，本研究通过应用黄芪多糖对乳腺癌细胞进行处理，导致β-catenin、c-myc、Cyclin D1的表达受抑制，从而推断黄芪多糖能够抑制Wnt/β-catenin通路的异常激活。

黄芪多糖在体外具有抑制乳腺癌细胞生长增殖、迁移和侵袭的作用，其机制可能为抑制Wnt/β-catenin信号通路导致。提示黄芪多糖可能应用于临床上三阴性乳腺癌的治疗，而不仅仅是补中益气作用。当然，黄芪多糖可能对乳腺癌发生发展中的其他信号通路也存在一定作用，这有待进一步研究。本研究探索了黄芪多糖抗三阴性乳腺癌的作用机制，为黄芪多糖的临床应用提供了一定的依据。

参考文献:

[2]顾恪波,何立丽,王逊,等.黄芪及其提取物对免疫功能的影响[J].辽宁中医杂志,2012,39(11):2326-2329.

[3]杜雪洋,梁建庆,何建成,等.黄芪多糖的药理作用研究[J].西部中医药,2019,32(6):152-155.

[4]桂壮,邵治国,金笛.黄芪多糖抑制人胃癌MKN45､MGC-803细胞生长的作用机制[J].中医学报,2018,33(4):525-528.

[5]赵媛媛,张楠,孙维义,等.黄芪多糖对裸鼠结直肠癌移植瘤的抑制作用[J].郑州大学学报(医学版),2021,56(3):375-379.

[6]宋寒宾,王慧,刘美,等.跨膜蛋白16A通过激活表皮生长因子受体信号通路促进乳腺癌细胞增殖的研究[J].中国临床药理学杂志,2021,37(7):832-836.

[7]张阳,衣鸣,陈晓光.汉黄芩苷抑制人乳腺癌MCF-7细胞转移及侵袭的分子机制研究[J].中国临床药理学杂志,2020,36(22):3674-3678.

[8]陈筠,孙莉.Wnt/β-catenin信号传导通路与早期胚胎心脏发育的关系[J].基础医学与临床,2010,30(1):103-106.

[10]张团结,任敏.乳腺癌中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达及意义[J].中国病理生理杂志,2018,34(11):2096-2100.

文章来源:李岩,王兴河.黄芪多糖对三阴性乳腺癌细胞增殖和侵袭作用的研究[J].中国临床药理学杂志,2023,39(20):2919-2922.