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沙旋覆花石油醚部位洗脱组分的体外抗肿瘤活性研究

2024-09-13 122 上传者：管理员

摘要：采用CCK-8法从沙旋覆花中筛选出具有抗肿瘤活性的石油醚部位洗脱组分，研究了其对人食管癌细胞Eca109增殖的抑制作用，并通过4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色法探究了其对Eca109细胞抑制作用的方式。结果表明，沙旋覆花石油醚部位洗脱组分（除23#外）对Eca109细胞具有不同程度的抑制作用，其中71#组分的抑制作用最强，对Eca109细胞的IC50值为8.19μg·mL-1;沙旋覆花石油醚部位洗脱组分可通过诱导细胞裂亡和凋亡发挥抗食管癌作用，为后续开展旋覆花属植物抗食管癌活性成分筛选与药效评价奠定了基础。

关键词：
CCK-8法
体外抗肿瘤活性
沙旋覆花
石油醚部位
食管癌
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食管癌是一种消化道难治性恶性肿瘤[1-2],我国是全球食管癌发病率最高的国家之一，食管癌发病率和死亡率分别位居恶性肿瘤第6位和第4位。由于发现晚和早期诊断率低[3],我国食管癌患者5年生存率约30%[4-5],因此，亟需开发新型抗食管癌药物。从传统中草药和植物中提取的紫杉醇、喜树碱、长春新碱等已被报道对癌症具有很好的疗效[6]。将中草药资源应用于食管癌治疗具有重要的经济和社会意义。

沙旋覆花[Inula salsoloides(Turcz.) Ostenf.]为菊科(Compositae)旋覆花属(InulaL.)多年生草本植物，又名黄花蒿、蓼子朴，主要分布于我国新疆、甘肃、陕西、内蒙古、河北、青海、山西北部和辽宁西部等地[7-8],民间常用作抗肿瘤药[9-10]。目前，关于沙旋覆花化学成分及其抗肿瘤活性的研究较少。为深入挖掘沙旋覆花的药用价值，进一步确定沙旋覆花抗肿瘤活性的物质基础，作者以新疆沙旋覆花为研究对象，采用CCK-8法从沙旋覆花中筛选出具有抗肿瘤活性的石油醚部位洗脱组分，研究其对人食管癌细胞Eca109增殖的抑制作用，并通过DAPI染色法探究其对Eca109细胞抑制作用的方式，为后续开展旋覆花属植物抗食管癌活性成分筛选与药效评价奠定基础。

1、实验

1.1 材料、试剂与仪器

沙旋覆花全草(粉碎，过40目筛),采自新疆和田地区，由新疆维吾尔自治区药物研究所民族药物研究室杨伟俊研究员鉴定为菊科旋覆花属植物沙旋覆花[I.salsoloides(Turcz.) Ostenf.]的全草。人食管癌细胞株Eca109、KYSE520,由中国医学科学院医药生物技术研究所提供。

磷酸盐缓冲液(PBS,批号AH29787891),美国HyClone公司；RPMI 1640培养基(批号WH0022D151),武汉普诺赛生命科技有限公司；胎牛血清(FBS,批号FS01-02),美国赛默飞世尔公司；0.25%胰酶(批号FG301-01),北京全式金生物技术股份有限公司；细胞增殖及毒性检测试剂盒(批号 ECKA362),武汉伊莱瑞特生物有限公司；二甲基亚砜(DMSO),北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇，天津致远化学试剂有限公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),美国MCE公司；实验用水均为蒸馏水。

HERAcell 150i型CO2细胞培养箱，美国Thermo Fisher公司；AB135-S型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；TGL-16K型台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；CX21型光学显微镜，日本OLYMPUS公司；SPARK型多功能微孔板检测仪，瑞士TECAN公司。

1.2 细胞培养

将人食管癌细胞株Eca109、KYSE520复苏后接种于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640完全培养基中，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养；隔天换液，及时传代，取对数生长期的Eca109、KYSE520细胞进行后续实验。

1.3 沙旋覆花各醇提物对Eca109、KYSE520细胞增殖的抑制作用

取适量沙旋覆花全草粉末，按料液比1∶20(g∶mL,下同)分别用50%、60%、70%、80%、90%、95%的乙醇加热回流提取3次，每次2 h, 上清液经蒸馏浓缩、真空干燥后，过100目筛，得到乙醇浸膏粗粉；取乙醇浸膏粗粉用DMSO溶解，采用CCK-8法示踪沙旋覆花各醇提物对Eca109、KYSE520细胞增殖的抑制作用，同时设置正常对照组(不加沙旋覆花醇提物);并采用紫外可见吸收光谱法对沙旋覆花50%、60%、70%、80%、90%、95%醇提物的波谱特征进行评价。

1.4 沙旋覆花抗肿瘤活性成分的提取分离及初步确认

取适量沙旋覆花全草粉末，按料液比1∶20分别用95%、50%的乙醇加热回流提取3次，每次2 h, 减压回收溶剂后，得到2 000 mL乙醇提取液；采用梯度萃取法，依次各用2 000 mL石油醚、乙酸乙酯萃取3次，每次2 h, 分别合并萃取液，减压回收溶剂，得到石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏；用氯仿溶解石油醚浸膏，按质量比1∶1.5拌以硅胶，干法上样后进行硅胶柱层析；依次用5 BV的石油醚-乙酸乙酯(体积比分别为10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5)、95%乙醇洗脱，按每管100 mL收集洗脱液；将各洗脱液点样于硅胶G薄层板，展开剂为石油醚-乙酸乙酯(6∶4),点样量为10 μL,根据比移值Rf相同或相近原则合并相同组分的洗脱液，即得沙旋覆花石油醚部位洗脱组分。

取对数生长期的Eca109细胞，用3 mL PBS清洗3次，加入300 μL胰酶于培养箱中消化2 min, 加入含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基终止消化，吹打均匀，制成单细胞混悬液；按每孔5 000个接种于96孔细胞培养板中，培养过夜；隔天加入石油醚部位洗脱组分(50 μg·mL-1)继续培养48 h; 同时设置空白对照组(不加Eca109细胞)和正常对照组(不加石油醚部位洗脱组分),每组设置3个复孔；实验结束时，去除培养液上清，每孔加入无血清培养液100 μL、CCK-8试剂10 μL,置于37 ℃培养箱中孵育0.5～4.0 h, 采用酶标仪测定450 nm处吸光度。按式(1)计算细胞存活率：

细胞存活率

1.5 沙旋覆花抗肿瘤活性成分的IC50值测定

取对数生长期的Eca109细胞，按每孔5 000个接种于96孔细胞培养板中，培养过夜；隔天弃培养液上清，加入优选出的66#、71#、72#、81#、98#、122#组分，按梯度浓度(5、10、20、50、100、200,μg·mL-1)继续作用48 h; 每组设置3个复孔，同时设置空白对照组(不加Eca109细胞)和正常对照组(不加石油醚部位洗脱组分);实验结束时，去除培养液上清，每孔加入无血清培养液100 μL、CCK-8试剂10 μL,置于37 ℃培养箱中孵育0.5～4.0 h, 采用酶标仪测定450 nm处吸光度。按式(1)计算细胞存活率，并计算半抑制浓度(IC50),作为后续实验中浓度设定的参考值。

1.6 DAPI染色法观察Eca109细胞核形态变化

取对数生长期的Eca109细胞，按每孔1×105个接种于有盖玻片的6孔板中，培养过夜；隔天弃培养液上清，加入不同浓度(5、10、20、50、100,μg·mL-1)的石油醚部位洗脱组分71#,继续培养48 h; 用4%多聚甲醛于4 ℃固定20 min; PBS洗涤3次后，加入1 μg·mL-1DAPI/PBS室温染色20 min; 依次用PBS洗涤3次、去离子水润洗1次，将盖玻片晾干、封片，用荧光显微镜观察并拍照。

2、结果与讨论

2.1 沙旋覆花各醇提物对Eca109、KYSE520细胞增殖的抑制作用(图1)

图1 沙旋覆花各醇提物(50 μg·mL-1)对Eca109、KYSE520细胞增殖的抑制作用

从图1可知，与正常对照组比较，95%醇提物(50 μg·mL-1)对Eca109、KYSE520细胞的增殖均有极显著的抑制作用(P<0.01)。因此，初步确认沙旋覆花抗肿瘤活性成分主要存在于95%醇提物中。

2.2 沙旋覆花各醇提物的紫外可见吸收光谱(图2)

图2 沙旋覆花各醇提物的紫外可见吸收光谱

箭头从上到下依次表示60%、50%、80%、70%、90%、95%醇提物

从图2可知，各醇提物具有相似的波谱特征，波形及波峰出现位置均一致，只是吸收强度略有不同。考虑到95%醇提物具有较强的抗肿瘤活性，同时根据相似相溶原理，50%乙醇相对可提取更多的强极性物质，后续采用95%、50%的乙醇对沙旋覆花全草的有效部位进行初步富集。

2.3 沙旋覆花抗肿瘤活性成分的初步确认

沙旋覆花石油醚部位经硅胶柱层析分离后，得到136个组分，通过薄层层析点样，选取具有代表性的24条薄层层析点样图谱(图3),按照Rf相同或相近原则进行合并，最终获得23个组分。考察23个组分对Eca109细胞存活率的影响，结果见表1。

从表1可知，与正常对照组比较，石油醚部位洗脱组分(除23#外)对Eca109细胞显示不同程度的抑制作用，其中66#、71#、72#、81#、98#、122#组分对Eca109细胞的抑制作用较强，尤其是71#、72#、81#、98#组分的抑制率高达95%以上，且具有统计学意义。

2.4 沙旋覆花抗肿瘤活性成分的IC50值

以不同浓度的66#、71#、72#、81#、98#、122#组分作用Eca109细胞48 h后，对Eca109细胞增殖的抑制率见表2。

从表2可知，随着各组分浓度的增加，对Eca109细胞的抑制率整体逐渐升高。计算得到66#、71#、72#、81#、98#、122#组分对Eca109细胞的IC50值(μg·mL-1)分别为14.30、8.19、19.98、23.21、26.58、52.51,其中71#组分对Eca109细胞的抑制作用最强。

图3 石油醚部位洗脱组分的薄层色谱图

表1 石油醚部位洗脱组分对Eca109细胞存活率的影响(n=3,Symbol`A@x±sd)

表2 石油醚部位洗脱组分66#、71#、72#、81#、98#、122#对Eca109细胞增殖的抑制率(n=3,

2.5 DAPI染色法观察Eca109细胞核形态变化

用抑制率较高的71#组分对Eca109细胞核进行染色，结果见图4。

从图4可知，71#组分可诱导Eca109细胞裂亡和凋亡。表明沙旋覆花石油醚部位洗脱组分对Eca109细胞有明显的抑制作用，可使细胞裂亡和凋亡，从而发挥抗食管癌活性。

2.6 讨论

目前，研究者对旋覆花、沙旋覆花的研究主要集中在鉴别、有效成分分离和药效等方面，特别是关于欧亚旋覆花的研究较多。倍半萜类化合物是旋覆花属植物中具有抗肿瘤作用的特征活性成分之一[11-17]。Zhou等[18]从欧亚旋覆花中分离得到4个新型倍半萜类化合物，其对HL-60、A549、MCF7、HCT-15、SK-OV-3和Malme-3M等6种人癌细胞株均有细胞毒性。Bai等[19]从欧亚旋覆花中分离得到3个新型倍半萜类化合物，其对人癌细胞COLO 205、HT29、HL-60和AGS均有细胞毒性。Zhang等[20]从欧亚旋覆花中分离得到3个新型倍半萜内酯化合物。相比欧亚旋覆花，研究者对新疆沙旋覆花的研究较少，且对沙旋覆花抗食管癌作用的物质基础及其作用机理尚不清楚。本研究以沙旋覆花的临床抗癌作用为基础，对沙旋覆花抗食管癌作用的物质基础及其作用机理进行研究。采用气质联用(GC-MS)法对沙旋覆花石油醚部位进行成分分析，得到了29个化合物，占色谱峰总面积的96.61%,主要为长链脂肪酸类和脂类[10],推测沙旋覆花石油醚部位的抗肿瘤活性可能与上述2类成分相关。本研究发现23#、30#、46#、51#组分的细胞存活率高达95%以上，可能与醇提物中成分较复杂、活性成分极性不同等因素有关，为沙旋覆花石油醚部位化学成分的进一步研究提供可能性；沙旋覆花石油醚部位洗脱组分可通过诱导细胞裂亡和凋亡对Eca109细胞进行抑制或杀灭，说明沙旋覆花具有较好的抗食管癌活性药用开发潜力。因此，非常有必要对沙旋覆花的天然活性物质及其抗肿瘤作用进行进一步探索。

图4 石油醚部位洗脱组分71#对Eca109细胞核形态的影响

3、结论

采用95%、50%乙醇对沙旋覆花全草的活性成分进行初步富集，再经极性萃取、分离纯化，得到沙旋覆花石油醚部位洗脱组分；采用CCK-8法研究了石油醚部位洗脱组分对Eca109细胞增殖的抑制作用。结果表明，石油醚部位洗脱组分(除23#外)对Eca109细胞显示不同程度的抑制作用，其中71#组分的抑制作用最强，对Eca109细胞的IC50值为8.19 μg·mL-1。DAPI染色结果显示，沙旋覆花石油醚部位洗脱组分可通过诱导细胞裂亡和凋亡发挥抗食管癌作用。该研究为后续开展旋覆花属植物抗食管癌活性成分筛选与药效评价奠定了基础。

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