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LNC01852通过调控Bcl-2对食管癌EC9706细胞增殖和凋亡的影响及作用机制

2021-10-12 140 上传者：管理员

摘要：目的:探究唑来膦酸对肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)表型转化和HGF表达的作用及对肺癌细胞增殖和耐药的影响。方法:通过Transwell系统将M2巨噬细胞与小鼠肺癌细胞Lewis共培养,得到M2型TAM(M2-TAMs)。采用不同浓度唑来膦酸作用于M2-TAMs,采用ELISA和RT-PCR检测M1型标记(IL-1β、TNFα、IL-6和iNOS)、M2型标记(HGF、EGF、IL-10和Arg1)的表达改变,采用Westernblot检测NF-κB的表达。建立TranswellM2-TAMs-Lewis共培养模型,采用MTT方法检测肿瘤细胞的增殖和对吉非替尼耐药的影响;采用NF-κB特异性抑制剂PDCT作用唑来膦酸处理的TAMs,进一步检测TAMsM1/M2表型改变。结果:随着唑来膦酸浓度的增加,TAMsM1表型显著增强,M2表型逐渐减弱;与对照组相比,唑来膦酸处理的TAMs显著抑制了肺癌细胞的增殖,增强了其对吉非替尼的敏感性。在NF-κB特异性抑制剂(PDTC)的作用下,唑来膦酸处理的TAMsM1表型减弱,而M2表型增强。结论:唑来膦酸通过活化NF-κB信号通路促进肿瘤相关巨噬细胞M1表型转化并抑制肺癌细胞的增殖和耐药。

关键词：
LNC01852
作用机制
凋亡
增殖
消化系统恶性肿瘤
食管癌
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食管癌是临床上常见的消化系统恶性肿瘤，是全球范围内第六大癌症相关死亡重要原因[1]。我国食管癌的发病率仅次于胃癌和肺癌，位居恶性肿瘤发病率和致死率第4位，且患者术后5年总体有效生存率低于30%[2]。大量临床资料统计分析显示，我国食管癌的发病率与死亡率仍然呈快速上升趋势，成为严重威胁人们生命安全的高发性恶性肿瘤[3]。由于早期食管癌患者缺乏典型的临床表征，往往极易导致忽视也容易造成漏诊，多数患者待到确诊时已经属于中、晚期，患者最终因错过最佳手术时机导致临床预后较差[4]。此外，目前临床广泛使用的放化疗疗效欠佳，且毒副作用较大，甚至造成机体不可逆性器质性损伤，进而加速病情恶化。因此，揭示食管癌的发病机制，并针对其发病机制探索靶向治疗药物，是当前临床抗食管癌治疗取得根本性突破迫切需要解决的难题。长链非编码RNA已被证实是一类无蛋白编码功能的新型转录产物，在肿瘤细胞的增殖、分化、转移和凋亡中发挥着多种作用。然而，LNC01852对食管癌的确切作用尚不清楚。本研究拟阐明LNC01852在食管癌发展进程中的作用及其机制，有望为临床抗食管癌治疗提供基因治疗靶点。

1、材料与方法

1.1材料与试剂

人食管癌细胞系EC9706、KYSE30、TE-13和食管黏膜上皮细胞系HET-1A均购自中科院上海细胞库；RPMA-1640培养基和胎牛血清均购自美国Gibco公司；0.25%胰蛋白酶、青链霉素混合液和脱脂奶粉均购自西安壮志生物科技有限公司；Lipofectamine2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；引物和siRNA均购自上海吉玛制药技术有限公司；实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂购自Takara生物试剂公司；MTS法细胞增殖试剂盒和流式细胞凋亡检测试剂盒购自武汉艾美捷生物科技有限公司；p53、Bcl-2和Bax抗体购自英国Abcam公司；β-Actin抗体购自美国CellSignalingTechnology公司；辣根过氧化物酶(HPR)标记的二抗购自武汉博士德生物科技有限公司；ECL化学发光液购自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及转染

人食管癌细胞系EC9706、KYSE30、TE-13和食管黏膜上皮细胞系HET-1A均采用含10%FBS和1%青链霉素混合液的RPMA-1640培养基于37℃、5%CO2孵箱中培养。取对数生长期的上述细胞系，采用0.25%胰蛋白酶消化、中和、离心后按照(5～8)×105个/2mL/孔细胞密度接种于6孔板，待细胞长满约70%,即可进行siRNA转染：分别取5μLsiRNA和Lipofectamine2000与50μLOpti-MEM混匀室温静置5min,随后将siRNA混合液缓慢加入Lipofectamine2000混合液中室温避光静置20min;将上述混合物加入6孔板，200μL/孔，置于37℃、5%CO2孵箱转染8h,弃上清加入完全RPMA-1640培养基继续培养24h(qRT-PCR)或48h(Westernblot)检测转染效率。同时设立阴性对照组。

1.2.2qRT-PCR检测LNC01852的表达

上述6孔板培养板中加入1mL/孔的TRIzol提取细胞总RNA,采用Takara公司5×PrimeScriptRTMasterMix反转录试剂盒获得cDNA,qRT-PCR依据Takara公司2×SYBRPremixExTaqII说明书进行。采用仪器自带软件进行分析，基因相对表达量根据2-ΔΔCt法进行计算，以GAPDH作为内参基因，检测细胞中LNC01852、p53、Bcl-2和Bax的mRNA表达水平，qRT-PCR引物序列见表1。

1.2.3MTS细胞增殖实验

细胞转染24h后，采用0.25%胰蛋白酶消化、中和、离心后，以1×104个/200μL/孔细胞密度接种于96孔板，置于37℃、5%CO2孵箱培养。分别于接种后1、2、3、4、5天内加入110μL/孔的MTS稀释液，37℃、5%CO2孵箱孵育2h,采用酶联免疫检测仪490nm读取光密度值(OD),绘制细胞生长曲线。

1.2.4克隆形成实验

细胞转染24h后，采用0.25%胰蛋白酶消化、中和、离心后，以300个/2mL/孔细胞密度接种于6孔板，置于37℃、5%CO2孵箱培养。铺板后第5天每孔加500μLFBS并密切观察菌落形成情况，待肉眼可见菌落形成，弃上清，将细胞经4%多聚甲醛固定和0.1%结晶紫染液染色后计数>50个细胞的菌落数。

1.2.5流式细胞术细胞凋亡检测

细胞转染24h后，采用0.25%胰蛋白酶消化、中和、离心后，每管加4mL预冷的PBS洗涤3次；采用200μL结合缓冲液重悬细胞并加10μLAnnexinⅤ-FITC和5μLPI,混匀后避光在4℃下反应30min;随后加300μL结合缓冲液，采用400目筛网过滤1次，于流式细胞仪检测细胞凋亡率，获取数据并分析散点图。

1.2.6Westernblot检测蛋白表达

细胞转染24h后，采用0.25%胰蛋白酶消化、中和、离心后，每管加入100μLPIPA裂解液+0.15μLPMSF室温裂解5min,4℃离心机12000r/min离心15min,将上清移入新的EP管中，并记录蛋白总体积；采用BCA法测定蛋白浓度并计算30μg蛋白上样体积，并进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳，ECL发光仪检测并记录蛋白表达量。

1.3统计学分析

数据分析采用SPSS22.0和Graphpadprism7软件。两组间计量资料比较采用t检验，以均数±标准差(x¯±s)表示，P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1qRT-PCR检测食管癌细胞系和食管上皮细胞系中LNC01852的表达

qRT-PCR检测结果如图1。结果表明人食管癌细胞系EC9706、KYSE30、TE-13中LNC01852的表达较正常食管上皮细胞系HET-1A显著上调(P<0.05),且EC9706细胞系中LNC01852的表达上调最显著，表明LNC01852的异常表达与食管癌的发生发展密切相关。

2.2qRT-PCR验证siLNC01852的转染效率

qRT-PCR检测结果如图2。结果表明人食管癌EC9706细胞转染siLNC01852后LNC01852的表达降低73.45%,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3MTS细胞增殖能力检测

MTS细胞增殖实验结果如图3。结果表明LNC01852敲减能够明显抑制人食管癌EC9706细胞的增殖能力，差异有显著统计学意义(P<0.05)。

2.4克隆形成实验检测细胞集落形成能力

克隆形成实验结果如图4。结果表明LNC01852敲减能够明显抑制人食管癌EC9706细胞的菌落形成能力，差异有显著统计学意义(P<0.05)。

2.5流式细胞术观察细胞凋亡情况

流式细胞凋亡实验结果如图5。结果表明敲减LNC01852能够明显促进人食管癌EC9706细胞发生凋亡，差异有显著统计学意义(P<0.05)。

2.6qRT-PCR检测p53-Bcl-2/Bax凋亡信号通路分子mRNA表达水平

qRT-PCR检测结果如图6。结果表明人食管癌细胞系EC9706中LNC01852敲减后能够显著上调促凋亡分子p53和Bax的mRNA表达，同时明显抑制抗凋亡分子Bcl-2的mRNA表达，差异有统计学意义(P<0.05),提示LNC01852通过介导p53-Bcl-2/Bax凋亡信号通路参与调控人食管癌EC9706细胞的凋亡。

2.7Westernblot检测p53-Bcl-2/Bax凋亡信号通路分子蛋白表达水平

Westernblot检测结果如图7。结果表明人食管癌细胞系EC9706中LNC01852敲减后能够显著上调促凋亡分子p53和Bax的蛋白表达，同时明显抑制抗凋亡分子Bcl-2的蛋白表达，差异有统计学意义(P<0.05),提示LNC01852对人食管癌EC9706细胞的凋亡调控通过p53-Bcl-2/Bax凋亡信号通路实现。

3、讨论

食管癌的发生发展是一个涉及多基因介导和多酶促反应参与的复杂调控网络，其中涉及到多个原癌基因的异常活化和抑癌基因的表达降低甚至缺失[8]。临床上食管癌的组织学亚型为鳞状细胞癌(SCC)和腺癌(AC),且两种亚型的发病率存在区域差异性[9]。据报道，SCC亚型在东南亚地区存在较高的发病率，约占整体食管癌病例总数的90%。而AC亚型在北美和欧洲等地区更为常见[10]。目前，食管癌切除术联合放化疗仍是食管癌患者的主要治疗方法，然而由于其较强的侵袭能力以及患者术后服用化疗药物伴随食欲减退、饱腹感强、吞咽困难等不良症状，影响患者生活质量，导致临床发病率和死亡率仍较高。因此，探究一种能够替代食管癌切除术的治疗策略和新型药物靶点，尤其对于早期食管癌患者是当前科研工作者急需攻克的重要难题。

lncRNA是一类长度超过200个核苷酸的无蛋白编码功能的RNA转录本[13]。近年来大量研究报道lncRNAs在肿瘤发生发展包括肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭转移、糖酵解以及血管生成等多种进程中均发挥重要调控作用，进而影响肿瘤的恶性演变[14]。LNC01852属于lncRNA家族成员，前期通过对TCGA数据库中食管癌患者组织样本中表达水平的检测发现其在癌组织中的表达显著高于癌旁组织，且与患者的临床病理分期呈明显正相关性，而与患者的预后效果呈负相关，提示LNC01852是一种潜在的促癌因子，但其对食管癌细胞增殖和凋亡的作用及其机制目前尚未见报道。本研究中qRT-PCR检测结果表明LNC01852在人食管癌细胞系EC9706、KYSE30、TE-13中的表达较正常食管上皮细胞系HET-1A显著上调(P<0.05),而转染siRNA敲减LNC01852能够显著抑制人食管癌EC9706细胞的增殖能力和菌落形成能力，并促进细胞发生凋亡，且尤以EC9706细胞系中上调最为显著，提示LNC01852的过表达可能与食管癌的发生发展密切相关。

细胞凋亡是正常或病理状态下细胞进行的一种程序性死亡过程，抗凋亡能力几乎是所有恶性肿瘤细胞的主要特征[15,16]。尽管多数情况下，细胞凋亡属于病理范畴，但靶向增强肿瘤细胞的凋亡路径有望成为临床肿瘤治疗新靶点和策略。p53是肿瘤进程中重要的抑癌分子，p53能够结合DNA作用及反式激活作用提示其参与细胞生长调控[17]。有研究表明，p53蛋白可通过调控Cipt基因表达参与调控细胞生长增殖。研究亦发现p53能够上调肿瘤细胞中p21和Bax基因的表达，从而导致细胞周期阻滞、DNA修复抑制并促进细胞凋亡。大量临床研究发现，高达50%的肿瘤患者体内存在p53基因的突变，突变后的p53丧失抑癌作用，进而加速肿瘤发展进程。此外，p53通过调控凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2的表达参与细胞凋亡的调控作用[18,19]。因此，p53可能通过抑制与DNA复制相关的细胞基因或基因产物而发挥作用。

Bcl-2基因家族及其相关蛋白是研究最早的与凋亡有关的基因，也是目前最受重视的调控细胞凋亡的基因家族。Bcl-2是一种重要的Bcl-2基因家族抗凋亡蛋白，其表达异常能够在不改变细胞增殖速度情况下，通过不同路径发挥细胞凋亡抵抗作用，进而增强活力并延长细胞寿命，最终促进肿瘤恶性发展[20]。有研究报道，Bcl-2基因的过度表达与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关，其主要通过延长细胞寿命，促进肿瘤细胞内基因改变得以积累，进而达到一定量变程度后诱导肿瘤转化[21]。研究发现，随着临床患者分化程度降低，Bcl-2的阳性表达率也降低，高分化肿瘤组织与低分化肿瘤组织内Bcl-2的阳性表达有显著性差异，且Bcl-2阳性患者的5年生存率明显低于阴性患者[22],上述研究结果提示Bcl-2基因的过度表达与肺癌患者的临床预后以及分化程度密切相关。

Bax是Bcl-2基因家族成员，是促进细胞凋亡的基因，现已被认为是最重要的促凋亡蛋白质之一，其在诱导细胞凋亡中发挥着关键作用。Bax是p53凋亡调控途径中的另一个重要下游基因，是p53的直接作用靶点[23]。研究表明，多种肿瘤中p53表达上调能够引起Bax的高表达，进而加速肿瘤细胞的凋亡，而p53突变后该作用明显被抑制。此外，研究发现Bax的促凋亡作用与Bcl-2的相对表达量密切相关，Bcl-2/Bax比值较低的肿瘤细胞的凋亡率显著高于Bcl-2/Bax比值高的肿瘤组织，表明Bax主要呈现通过抵抗Bcl-2的抑制凋亡作用而发挥较强的凋亡促进作用，二者共同决定着细胞是否走向凋亡[24]。我们的研究通过采用qRT-PCR和Westernblot法进一步证实，敲减LNC01852能够明显上调人食管癌EC9706细胞中促凋亡分子p53和Bax的mRNA和蛋白表达，同时明显抑制抗凋亡分子Bcl-2的mRNA和蛋白表达，差异有统计学意义(P<0.05)。上述研究结果提示，LNC01852通过激活p53-Bcl-2/Bax凋亡信号通路活性，上调促凋亡蛋白p53和Bax的表达，同时抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达诱导细胞凋亡。

综上所述，原癌基因LNC01852通过调控p53-Bcl-2/Bax凋亡信号通路活性，发挥促人食管癌EC9706细胞增殖和抑制细胞凋亡作用，靶向调控LNC01852或其下游p53-Bcl-2/Bax凋亡信号通路标志分子，有望为临床抗食管癌治疗提供新的治疗路径和靶点，并为临床食管癌的靶向治疗提供重要的理论和实验依据。

文章来源：李蓉蓉,殷先利,刘振洋,杨晓琳.LNC01852通过调控Bcl-2对食管癌EC9706细胞增殖和凋亡的影响及作用机制[J].现代肿瘤医学,2021,29(22):3889-3894