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自噬蛋白Beclin-1与N-myc下游调控基因2在细胞癌中的研究

2023-11-10 61 上传者：管理员

摘要：目的探索自噬蛋白Beclin-1和N-myc下游调控基因2(NDRG2)在食管鳞状细胞癌(ESCC)中的表达，并探讨两种蛋白作为ESCC预后分子标志物的临床价值。方法采用免疫组织化学染色检测Beclin-1与NDRG2在121例ESCC组织中的表达，通过Pearson相关分析两者表达与临床病理参数的关系。根据Beclin-1与NDRG2的表达情况将所有患者分为2组，高、低表达组的生存概率通过Kaplan-Meier曲线计算，Log-rank检验用于生存分析的比较。采用Cox比例风险模型进行单因素和多因素分析，确定ESCC患者的独立预后因子。结果免疫组织化学染色分析显示Beclin-1蛋白在121例ESCC及癌旁组织中的阳性表达率分别为40.5%(49/121)和59.5%(68/121),差异有统计学意义(χ2=5.973,P=0.015)。NDRG2蛋白在ESCC组织中的阳性表达率亦明显低于癌旁组织，差异有统计学意义(46.3%vs.61.2%;χ2=5.385,P=0.020)。Beclin-1低表达者有更为频繁的淋巴结转移(χ2=6.158,P=0.013)和更晚的TNM分期(χ2=4.538,P=0.033),而NDRG2低表达与更晚的T分期(χ2=6.607,P=0.010)和TNM分期(χ2=5.744,P=0.017)相关。Kaplan-Meier曲线显示，Beclin-1低表达与高表达患者的3年总体生存(OS)率分别为44.3%和60.9%,差异有统计学意义(χ2=5.696,P=0.017)。NDRG2低表达者的预后亦明显低于NDRG2高表达者，3年OS率分别为43.9%和59.2%(χ2=9.004,P=0.003)。单、多因素Cox比例风险模型分析表明，Beclin-1低表达(HR=1.727,95%CI:1.017～2.934,P=0.043)、NDRG2低表达(HR=1.671,95%CI:1.023～2.730,P=0.040)与TNMⅡ～Ⅲ期(HR=3.823,95%CI:2.133～6.852,P<0.001)是ESCC患者预后不良的独立预测因素。结论 Beclin-1和NDRG2表达在ESCC中明显下调，且与患者不良预后相关，其可能是预测ESCC患者生存的预后标志物。

关键词：
Beclin-1
N-myc下游调控基因2
分子标志物
预后
食管鳞状细胞癌
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食管癌是最具侵袭性的恶性肿瘤之一，被列为全球第六大常见的癌症死亡原因[1]。流行病学研究表明，食管癌具有明显的地理、种族和性别差异，食管鳞状细胞癌(ESCC)是东亚地区最常见的食管癌组织学类型，在我国约90%的食管癌为ESCC[2,3]。与食管腺癌相比，ESCC恶性程度高、生物侵袭性强，尽管近年来诊断与治疗策略已取得了重大的进展，但患者总体生存(OS)率仍然很低[4,5]。为了提高ESCC的早期诊断和改善患者预后，迫切需要寻找有价值的分子标志物和新型治疗靶点。

自噬是真核细胞降解、去除受损的细胞器或突变的细胞成分，维持细胞内环境稳定的重要途径[6]。既往研究发现，异常的细胞自噬与癌症、阿尔茨海默病等多种疾病有关[7,8,9]。随着肿瘤的恶性增殖，癌细胞由于营养缺乏，可以通过自噬获得能量并降解其内部成分以支持肿瘤的增殖和代谢。作为第一个自噬特异性基因，Beclin-1在细胞自噬的调节中发挥着重要作用[10,11]。目前，多项研究显示Beclin-1在非小细胞肺癌、胃癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤组织中存在表达缺失，并参与了肿瘤的发生发展[12,13,14]。然而，Beclin-1作为ESCC患者预后标志物的临床价值尚有待进一步研究。N-myc下游调控基因2(NDRG2)是N-myc下调基因家族的成员之一，该家族的蛋白质以α/β水解酶折叠为主要特征[15]。越来越多的证据表明，NDRG2作为一种肿瘤抑制因子，在癌细胞的增殖、黏附、侵袭和转移等方面发挥关键作用[16,17]。此外，NDRG2的表达抑制被报道与多种肿瘤的治疗结果及不良预后密切相关[18,19]。有研究表明，上调NDRG2可抑制食管癌细胞的增殖、侵袭、迁移和上皮-间充质转化(EMT)等的生物学行为[20]。然而，NDRG2在ESCC患者中的潜在预后价值仍不清楚。因此，本研究的主要目的是通过免疫组织化学染色检测Beclin-1与NDRG2在ESCC组织样本中的表达水平，并分析两者与患者临床病理特征及预后的关系，旨在探讨两种蛋白作为ESCC预后分子标志物的价值。

1、资料与方法

1.1 一般资料

本研究选择2015年6月至2018年10月在本院胸外科接受食管癌根治性切除手术的121例ESCC患者作为研究对象，前瞻性收集其手术切除标本(包括未受肿瘤侵犯的癌旁正常组织)及临床病理资料，其中男63例(52.1%)、女58例(47.9%),平均年龄为(67.3±11.4)岁，平均肿瘤最大径(5.41±1.93) cm, 高、中、低分化癌分别占42.1%(51/121)、38.0%(46/121)和19.9%(24/121);根据第8版食管癌TNM分期，Ⅱ～Ⅲ期病例占所有患者的54.5%。所有入选本研究的患者均应符合以下条件：(1)ESCC的诊断经术后组织病理学证实；(2)无肺、骨、肝等远处转移；(3)临床病理资料完整；(4)随访时间大于1个月。

本研究经本院伦理委员会批准，所有组织样本与临床病理资料均在患者知情同意的情况下采集。

1.2 免疫组化染色与结果判读

将手术切除的ESCC肿瘤组织经福尔马林固定、石蜡包埋后，制成厚度为4 μm的连续切片，进行免疫组织化学染色与分析。组织切片用二甲苯脱蜡，在浓度递增的乙醇中水化。使用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后，置于pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液中微波加热孵育20 min, 用以抗原修复。随后，在切片上加入3%的H2O2溶液，阻断内源性过氧化物酶活性。PBS冲洗后，将组织切片与1∶200比例稀释的Beclin-1(产品编号：SC11427,Santa Cruz公司，美国)与NDRG2一抗混合，并在4 ℃下孵育过夜。次日，将组织切片与辣根过氧化物酶标记的IgG二抗继续孵育30 min。使用二氨基联苯胺显色剂处理所有载玻片，并以苏木精复染、梯度乙醇脱水，中性树胶封片固定。

由两位高年资病理科医生对组织切片进行独立评估，根据Beclin-1、NDRG2的染色强度和阳性染色细胞数量进行半定量分析。染色强度的评分标准如下：阴性为0分、浅黄色为1分、棕黄色为2分、棕色为3分。阳性染色细胞数量的评分标准：在光学显微镜下随机选取5个高倍视野，每个视野计数200个细胞，阳性染色细胞比例<5%为0分，比例5%～25%为1分，比例>25%～50%为2分，比例>50%～75%为3分，阳性染色细胞比例>75%为4分。Beclin-1、NDRG2蛋白免疫组化染色的最终得分由染色强度与阳性染色细胞比例的分数乘积计算得出。将≤4分者纳入Beclin-1或NDRG2低表达组(阴性表达),>4分者分入Beclin-1或NDRG2高表达组(阳性表达)。如果两位评价者的结果有冲突，则由第3位病理学家进行复核，并协商得出相对一致的结果。

1.3 随访

本科负责对所有研究对象进行定期随访，通过查阅门诊或住院病例及电话探访等方式了解患者的生存状态。生存分析的主要研究结局为OS,所有患者的OS从手术当天开始计算，直至因任何原因死亡或最后一次随访作为观察终点。截至末次随访，全组无失访病例，中位随访时间为35.0个月。

1.4 统计学处理

采用SPSS23.0软件进行数据收集、处理和统计分析，采用Pearson相关评估Beclin-1、NDRG2表达与临床病理变量之间的相关性。高、低表达组ESCC患者的生存概率通过Kaplan-Meier曲线计算，Log-rank检验用于生存分析的比较。采用Cox比例风险模型进行单因素和多因素分析，确定ESCC患者的独立预后因子，在单因素分析中的显著变量被纳入多因素分析进一步评估。风险比(HR)和95%置信区间(CI)用于评估测试参数对死亡事件的影响。上述所有统计检验均为双侧分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 Beclin-1、NDRG2在ESCC组织中的表达及其临床意义

Beclin-1和NDRG2蛋白在ESCC组织中的免疫组化表达结果如图1所示，Beclin-1、NDRG2的阳性表达主要定位于正常食管上皮细胞的细胞质中。在检测的121例样本中，Beclin-1蛋白在ESCC肿瘤组织中的阳性表达率为40.5%(49/121),明显低于癌旁组织的59.5%(68/121),差异有统计学意义(χ2=5.973,P=0.015)。NDRG2蛋白在ESCC组织中的阳性表达率亦明显低于癌旁组织，分别为46.3%(56/121)和61.2%(74/121),差异有统计学意义(χ2=5.385,P=0.020)。免疫组化染色的结果证实与癌旁组织相比，Beclin-1和NDRG2蛋白在ESCC组织中呈明显低表达。

图1 Beclin-1和NDRG2蛋白在ESCC组织中的免疫组化染色结果(×200)

分析Beclin-1和NDRG2表达与ESCC临床病理特征的关系，如表1、表2所示，Beclin-1低表达者有更为频繁的淋巴结转移(χ2=6.158,P=0.013)和更为进展的TNM分期(χ2=4.538,P=0.033),而NDRG2低表达与更晚的T分期(χ2=6.607,P=0.010)和TNM分期(χ2=5.744,P=0.017)相关。然而，未发现Beclin-1和NDRG2表达与患者年龄、性别、组织学分化或肿瘤最大径之间存在显著性关系(P>0.05)。

2.2 Beclin-1、NDRG2表达在ESCC患者中的预后意义

在这个队列中，所有ESCC患者的3年和5年OS率分别为51.0%和31.4%,Kaplan-Meier生存曲线显示Beclin-1低表达与高表达患者的3年OS率分别为44.3%和60.9%,Beclin-1低表达与ESCC患者不良预后显著相关(χ2= 5.696,P=0.017),如图2A所示。此外，NDRG2低表达者的预后亦明显劣于NDRG2高表达者，3年OS率分别为43.9%和59.2%,差异有统计学意义 (χ2=9.004,P=0.003),如图2B所示。

图2 Beclin-1、NDRG2表达与ESCC患者OS的关系

单因素Cox分析结果显示，组织学分化(P=0.002)、TNM分期(P<0.001)、Beclin-1(P=0.020)及NDRG2低表达 (P=0.004)与ESCC患者的低OS率显著相关。在多因素Cox回归模型中对这些参数做进一步调整，结果证实Beclin-1低表达(HR=1.727,95%CI:1.017～2.934,P=0.043)、NDRG2低表达(HR=1.671,95%CI:1.023～2.730,P=0.040)及TNM Ⅱ～Ⅲ期(HR=3.823,95%CI:2.133～6.852,P<0.001)是ESCC患者预后不良的的独立预测因素。

表1 Beclin-1表达与ESCC患者临床病理特征的关系[n(%)]

表2 NDRG2表达与ESCC患者临床病理特征的关系[n(%)]

表3 ESCC患者预后因素的单、多变量Cox回归分析

3、讨论

自噬在保护和杀伤肿瘤细胞方面扮演着双重作用，已成为目前肿瘤学研究的一个重要方向[21,22]。Beclin-1是细胞自噬过程中的一个关键调节因子，其表达变化也被报道与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。在本研究中，本文通过免疫组织化学发现Beclin-1在ESCC组织中的表达明显低于癌旁组织，其低表达与肿瘤TNM分期和淋巴结转移显著相关，是ESCC患者预后不良的独立预测因素。Beclin-1异常表达及其在肿瘤癌变、进展中的作用已逐渐被认识，多数研究表明，Beclin-1通过细胞自噬维持基因组的稳定性，在癌变的早期阶段显示出抑制作用。据报道，研究人员在约58.3%的卵巢癌、60.0%的胃癌和70.0%的肺癌中观察到了Beclin-1的表达缺失[13,23,24]。ALABIAD等[23]的研究表明，Beclin-1在浆液性卵巢癌组织中的低表达与低分化癌和晚期肿瘤显著相关，是肝癌、乳腺癌等患者复发转移及预后不良的预测标志。这些研究结果表明，Beclin-1在包括ESCC在内的恶性肿瘤中低表达，可能引起细胞自噬活性受到抑制，肿瘤细胞失去自噬能力而逐渐获得逃避细胞凋亡和增殖、侵袭的能力，促进肿瘤的发生与转移。GUO等[25]报道Beclin-1表达缺失明显加快了食管癌细胞在体外的增殖速度，提高了细胞的抗凋亡与迁移能力。因此，以Beclin-1作为治疗靶点抑制ESCC的发生和进展，或许可以为改善治疗结果和延长患者生存提供方向。

NDRG2参与了细胞增殖、分化等多种病理生理过程，作为另一个新发现的肿瘤抑制因子同样备受关注。有研究发现，NDRG2在多种人类癌症中表达下调，与肿瘤的侵袭性特征与不良预后密切相关[26,27,28]。本研究的结果显示，NDRG2在ESCC样本中的表达明显低于癌旁组织，其低表达与更晚的T分期、TNM分期有关，提示NDRG2表达缺失可能在ESCC的进展中发挥关键作用。本研究发现NDRG2低表达患者的OS率明显低于高表达者，NDRG2是ESCC患者的独立预后因子。YANG等[20]的研究证实了本文的推测，发现食管癌细胞中的NDRG2表达明显低于正常食管上皮细胞，而上调NDRG2表达可显著减少细胞在体外形成集落的数量，抑制细胞的侵袭、迁移能力并促进细胞凋亡。体内动物实验也表明NDRG2对肿瘤生长具有显著抑制作用。此外，有研究报道了NDRG2表达缺失对EMT的诱导作用，NDRG2可通过影响E-钙黏蛋白、波形蛋白、基质金属蛋白酶的表达，调节肿瘤细胞的侵袭、转移能力[29,30]。这些数据进一步支持NDRG2表达缺失参与了ESCC的发生发展，揭示了其作为ESCC患者预后分子标志与治疗靶点的潜在价值。

综上所述，本研究发现Beclin-1和NDRG2在ESCC样本中存在明显低表达，两者的表达水平与T分期、淋巴结转移和TNM分期显著相关，可作为ESCC患者预后不良的预测分子。这些信息有助于进一步探索Beclin-1和NDRG2蛋白在ESCC发生发展中的生物学功能及作用机制，并为分子靶向治疗提供潜在靶点。

基金资助:山西省卫生健康委员会2021年度“四个一批”科技兴医创新计划项目(2021016);

文章来源:张颖,王宇.自噬蛋白Beclin-1与N-myc下游调控基因2在食管鳞状细胞癌中的表达及其临床意义[J].国际检验医学杂志,2023,44(21):2592-2597.