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CaMK4对狼疮性肾炎患者外周血中γδT细胞功能的影响

2024-10-16 146 上传者：管理员

摘要：目的：本文探讨钙/钙调素依赖性蛋白激酶（CaMK4）对LN患者外周血中γδT细胞功能的影响。方法：流式细胞术比较LN患者及健康对照组外周血中γδT细胞的比例，磁珠分选LN患者和健康对照组外周血中的γδT细胞，RNA-SEQ分析两组中γδT细胞的差异基因。Real-time PCR和Western blot验证差异基因CaMK4的表达水平，流式细胞术检测CaMK4抑制剂处理后γδT细胞表面CD80,CD86和CD40L的表达水平，ELISA检测CaMK4抑制剂处理后γδT细胞分泌IL-17的水平。结果：LN患者外周血中γδT细胞的比例低于健康对照组（P<0.05）。RNA-SEQ测序共筛选出28个与LN有关的差异基因，其中CaMK4在LN患者和健康对照者间差异显著。LN患者外周血中γδT细胞经过CaMK4阻断剂KN-93处理后，表面共刺激分子CD80、CD86和CD40L的表达下降、分泌的IL-17水平也下降（P<0.01）。结论：CaMK4通过调控γδT细胞分泌IL-17和共刺激分子表达参与LN发病，抑制CaMK4或可成为治疗LN的新靶点。

关键词：
CaMK4
IL-17
γδT细胞
狼疮性肾炎
自身免疫性疾病
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系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种系统性自身免疫性疾病，好发于年轻女性，男女发病比例为1∶9，临床表现复杂多变，常累及多个器官，迁延难愈[1]。其中狼疮性肾炎（lupus nephritis,LN）是SLE最严重的并发症，临床上50%以上的SLE患者肾脏负担加重，约占继发性肾小球疾病的70%[2-4]。LN的发病机制复杂多样，主要特征为淋巴细胞过度活化、多种炎症因子及大量抗体产生、免疫细胞和免疫分子调控网络紊乱等。γδT细胞是一类重要的天然免疫细胞，在SLE等自身免疫性疾病中发挥重要的作用。研究表明，γδT细胞可通过分泌IL-17参与SLE的疾病进程，也可通过表达HLA-DR和CD80/CD86等共刺激分子活化αβT细胞，以及表达共刺激分子CD40L等活化B细胞，形成促SLE进展的免疫网络[5-6]。但其在LN中的具体作用机制尚未见报道。

钙/钙调素依赖性蛋白激酶（Calcium/calmodu⁃lin-dependent protein kinase,CaMK4）是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸激酶，可调节各种炎症和免疫反应。CaMK4可通过IL-6促进肾基底膜细胞增殖从而参与LN的发病[7]，同时，CaMK4可介导αβT细胞异常活化，并通过在淋巴组织和炎症肾脏中产生大量IL-17从而促进LN的进展[8-9]。CaMK4也可促进SLE患者αβT细胞中葡萄糖转运蛋白GLUT1的异常表达，参与糖酵解，有助于IL-17的产生[10]。那么，在LN发病过程中，CaMK4能否调控γδT细胞分泌IL-17？此外，CaMK4还可促进共刺激因子的表达，参与抗原提呈的过程[11]。那么，CaMK4能否调控同样具有抗原提呈能力的γδT细胞？本研究根据上述两个科学问题，探讨CaMK4对LN患者外周血中γδT细胞表达共刺激分子和分泌IL-17能力的影响，为寻找LN治疗新靶点、开发基于CaMK4抑制剂作为LN临床治疗策略奠定基础。

1、资料与方法

1.1资料

1.1.1试剂与仪器

KN-93购自Sigma-Aldrich公司；抗人IL-17A(512304）购自Biolegend公司；胎牛血清购自Gibco公司；PE标记的CD80、CD86、CD40L抗体，以及抗人TCRγδ抗体购自Biolegend公司，IL-17的ELISA试剂盒购自Ebioscience公司；Triozol购自Invitrogen公司；逆转录酶购自Promega公司；SYBR Green购自ToBoYo公司。细胞固定液和破膜剂购自BD公司，γδT细胞分选磁珠购自美天旎公司，PCR引物由生工公司合成。CytExpert流式细胞仪购自Beckman公司。

1.1.2一般资料

于湖北医药学院附属人民医院收集16例单纯SLE患者，16例LN患者和16例健康对照外周血，所有受试者均未并发肿瘤、感染或其他自身免疫性疾病。本研究经湖北医药学院临床伦理委员会批准（2022-PR-026）。所有受试者都知情并同意参与此项研究。

1.2方法

1.2.1磁珠分选

γδT细胞分选采用阳性分选磁珠（130-050-701），收集细胞悬液后，加入缓冲液1 ml,300 g离心5 min，弃上清，将细胞沉淀重悬于80µl缓冲液中，加入γδT细胞分选磁珠20µl,4℃孵育30 min，然后加入缓冲液1 ml重悬细胞，300 g离心5 min，弃上清，沉淀重悬于500µl缓冲液中。重悬液滴入分选柱中，使其慢慢流入，待细胞悬液滴入完毕后，将分选柱从磁力架上移下，向分选柱中加入500µl洗液，以活塞推动细胞，收集细胞，此为阳性分选的γδT细胞。

1.2.2 RNA-Seq

磁珠分选3例LN患者和健康对照者的γδT细胞，用作RNA样本制备的输入材料，分别提取其RNA，进行RNA-Seq实验。实验由诺禾致源公司完成测序并分析。使用DESeq2 R软件对LN患者及健康对照RNA-Seq结果进行差异表达分析，P<0.05的基因被认定为差异表达基因。

1.2.3 ELISA

通过ELISA试剂盒测定培养细胞上清中IL-17的水平，操作方法按说明书执行。

1.2.4 Real-time PCR

通过Real-time PCR检测对照组和实验组细胞中目标基因mRNA的表达水平。提取各组细胞总RNA,MMLV反转录成cDNA，再以cDNA为模板，通过PCR扩增CaMK4，内参为GAP⁃DH。之后对熔解曲线进行分析，确保只有单一产物被扩增，然后使用Bio-Rad CFX manager3.1软件进行基因表达分析。

1.2.5流式细胞术

离心收集磁珠分选阳性的γδT细胞，PBS洗涤细胞2次后，以100µl PBS重悬细胞，加入1µl PE标记的CD80、CD86和CD40L抗体，4℃避光作用30 min后，应用CytExpert流式细胞仪检测细胞表面CD80、CD86和CD40L的表达情况。对于γδT17细胞的染色，先加入PE标记的TCRγδ抗体，4℃避光作用30 min后，向细胞中加入200µl固定液和透膜，4℃作用15 min。清洗细胞后，用FITC标记的抗人IL-17A染色30 min，检测各组γδT17细胞数量。

1.2.6 Western blot

SDS-PAGE电泳分离γδT细胞蛋白样本，转印到PVDF膜上，先后加入抗CaMK4抗体以及相应的二抗。洗液洗去多余的二抗后，加入ECL显影。

1.3统计学处理

所有数据均使用SPSS19.0和GraphPad 6.0软件进行分析。采用独立样本T检验比较LN患者和健康对照组的均值。使用配对样本t检验比较LN患者组处理前后的平均值。P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 LN患者外周血中γδT细胞比例降低，γδT17细胞比例升高

通过流式细胞术检测16例单纯SLE患者、16例LN患者和16例健康对照外周血中γδT细胞及分泌IL-17的γδT17细胞比例。在三组病例组中，LN患者及单纯SLE患者的γδT细胞比例均较正常健康对照组比例降低，其中LN患者γδT细胞比例最低（P<0.05），但γδT17细胞比例升高（P<0.05，图1），提示LN患者可能含有更多分泌IL-17的γδT细胞。

2.2 RNA-Seq筛选差异基因

为进一步明确γδT在LN致病中的作用，对3例γδT17比例高的LN患者，磁珠分选出外周血γδT细胞，和健康对照组进行了RNA-Seq的分析，T1、T2、T3代表3例LN患者外周血中的γδT细胞，C1、C2、C3代表3例健康对照者外周血中的γδT细胞，发现了三组中具有表达差异的568个基因（图2）。

2.3与SLE有关的差异基因

对差异基因进一步筛选，根据注释，找到了与SLE发病相关的16个上调差异基因，12个下调差异基因，见表1。

2.4 CaMK4在LN患者外周血γδT细胞中高表达

应用Real-time PCR方法对其中差异显著的上调基因（差异倍数>3）进行扩大样本量的验证，结果证明ANKRD1、DKK、SERPINE1、RASGRP3、DUSP1、ADM和CCR2在16例LN患者外周血γδT细胞中差异无统计学意义。LN组只有CaMK4的表达与健康对照组相比差异具有统计学意义（P<0.05，图3A）。同时检测了3例LN患者γδT细胞CaMK4的蛋白表达情况，Western blot证明，LN患者外周血γδT细胞CaMK4的表达高于健康对照者（图3B,H1,H2,H3代表3例健康对照者；L1,L2,L3代表3例LN患者）。

图1 LN患者外周血中γδT细胞比例下降，γδT17细胞比例升高

2.5 CaMK4抑制剂KN-93可降低LN患者γδT细胞表达相关协同刺激分子

为了证明CaMK4对γδT细胞的调控作用，分选出3例LN患者外周血中γδT细胞，经过KN-93(0.5µmol/L）处理24 h后，流式细胞术检测其表面协同刺激分子的表达。结果证明，与未加入任何处理的对照组相比（红色线条），CaMK4抑制剂可降低γδT细胞表面CD80、CD86和CD40L的表达（绿色线条，图4）。

图2 RNA-Seq筛选差异基因

表1与SLE发病有关的差异基因

图3 CaMK4在LN患者外周血γδT细胞中高表达

图4 CaMK4抑制剂可降低LN患者γδT细胞相关协同刺激分子表达

2.6 CaMK4抑制剂KN-93可降低LN患者γδT细胞分泌IL-17的水平

在先前实验证明KN-93对CaMK4有抑制作用的前提下，为进一步证明CaMK4对γδT细胞的调控作用，分选出16例LN患者外周血中γδT细胞，经过CaMK4抑制剂KN-93(0.5µmol/L）处理24 h后，使用Real-time PCR和ELISA检测IL-17的分泌情况。分子水平和蛋白水平检测结果证明，与未加入任何处理的对照组相比，CaMK4抑制剂可降低γδT细胞IL-17的分泌（P<0.01，图5）。

图5 CaMK4抑制剂可降低LN患者γδT细胞分泌IL-17的水平

3、讨论

在众多免疫分子中，IL-17在LN致病中的作用近年来尤为引人关注。IL-17是一种炎症细胞因子，参与许多炎症性疾病和自身免疫性疾病的发病及进展[12]。SLE患者血清中IL-17的含量明显增加，并与疾病的活动度密切相关[13]。同时，高水平的IL-17可作为LN患者使用免疫抑制剂治疗后不良预后的判断指标[14]。IL-17的主要来源是Th17细胞，但也有研究显示，天然免疫细胞中的γδT细胞在某些微环境下是IL-17的主要来源[15]。由于γδT细胞发生了凋亡、自噬或过度激活，SLE患者外周血中，γδT细胞比例降低，但相关组织中γδT细胞的数量增加[16-17]。通常情况下，外周血中的免疫细胞在趋化因子的作用下趋化到炎症部位，参与局部病理改变[18]。本研究分离得到16例单纯SLE患者、16例LN患者和16例健康对照外周血，流式细胞术检测外周血中γδT细胞的水平，LN患者以及单纯的SLE患者中的γδT细胞比例均较正常健康对照组比例降低，其中LN患者γδT细胞比例最低，但分泌IL-17的γδT17细胞增加，提示分泌IL-17的γδT细胞可能在LN中发挥更为重要的作用。对3例γδT17比例高的LN患者，与正常对照组进行了RNA-Seq的分析，共发现了568个表达差异基因，对差异基因进行进一步筛选，根据注释，我们找到了与SLE发病相关的16个上调差异基因，12个下调差异基因，经过验证，LN患者CaMK4在分子水平和蛋白水平的表达均高于健康对照组。

除了分泌与炎症相关的细胞因子，γδT细胞还具有包括抗原提呈及直接杀细胞效应在内的多种生物学作用，研究表明，在SLE的发病进程中，γδT细胞也可通过表达HLA-DR和CD80/CD86等共刺激分子活化αβT细胞，以及表达共刺激分子CD40L等活化B细胞。为了证明CaMK4对γδT细胞的调控作用，采用磁珠分选出LN患者外周血γδT细胞，经过CaMK4抑制剂KN-93处理后，发现γδT细胞CD80、CD86和CD40L表达下降。说明CaMK4可下调γδT细胞表面共刺激分子的水平，抑制其抗原提呈功能。同时KN-93可抑制γδT细胞分泌IL-17，这与本课题组以前的实验结果一致[19]。由此提出如下假说：CaMK4可通过促进γδT细胞分泌IL-17，并增强其抗原提呈能力，活化αβT细胞及B细胞，参与LN的发生发展。这一机制为探讨LN治疗新靶点、开发基于CaMK4抑制剂作为LN临床治疗策略提供思路。

文章来源:王钟毓,王洋彬,雷飞飞,等.CaMK4对狼疮性肾炎患者外周血中γδT细胞功能的影响[J].中国免疫学杂志,2024,40(10):2158-2162.