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NMU基因敲除鼠胰腺原位荷瘤模型的构建及研究意义

2024-10-16 141 上传者：管理员

摘要：目的:利用C57BL/6 NMU基因敲除小鼠，构建胰腺原位荷瘤模型，为研究胰腺癌发生发展的分子机制并寻找新的免疫治疗策略提供前提基础。方法:根据NMU基因序列结构，在第二个外显子内设计敲除鉴定引物，用PCR以及琼脂糖凝胶电泳手段鉴定基因型。将杂合子小鼠采用雌雄2∶1按比例合笼进行扩繁，以期得到NMU基因敲除纯合子小鼠。将2×10～7的Panc02细胞接种NMU基因敲除纯合子小鼠胰尾，构建原位荷瘤模型。生物信息学分析NMU差异表达、患者生存周期、临床病理分析研究和肿瘤免疫微环境变化。流式细胞术分析NMU敲除后荷瘤小鼠脾脏中CD8+T细胞浸润情况。结果:C57BL/6 NMU基因敲除杂合子小鼠经过繁育与鉴定得到NMU基因敲除纯合子鼠，其胰尾接种Panc02细胞后成功构建胰腺原位肿瘤模型。生物信息学分析表明NMU作为胰腺癌发展中的早期且持续事件，引起患者预后不良，使肿瘤微环境呈免疫抑制状态。流式细胞术表明NMU敲除后荷瘤小鼠全身免疫景观中CD8+T细胞表达增多。结论:构建C57BL/6 NMU基因敲除小鼠胰腺原位荷瘤模型，对研究NMU作为胰腺癌发生发展中预后不良事件、胰腺癌免疫抑制机制的研究具有重要意义。

关键词：
NMU
基因型鉴定
流式细胞术
生物信息学分析
胰腺原位荷瘤
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神经介素U(neuromedin U,NMU)来源于胆碱能神经元，作为参与肿瘤的发生和影响患者预后的新靶标被广泛关注。因胰腺癌的隐匿发病无法及时获取早期病灶进行研究，建立合适的生物模型，对研究胰腺癌发生发展的分子机制并寻找新的治疗策略至关重要[1]。生物信息学分析发现NMU可视为胰腺癌早期诊断标志及对患者预后具有提示作用。利用C57BL/6 NMU基因敲除的纯合子小鼠构建胰腺原位荷瘤模型，以期待探讨NMU在胰腺癌发生发展中的作用，对临床胰腺癌诊断和免疫治疗进行研究。

1、材料与方法

1.1材料

C57BL/ 6NMU基因敲除杂合子小鼠购自赛业(苏州)生物科技有限公司。Panc02胰腺癌细胞系购自中国科学院细胞库。Matrigel Basement Membrane Matrix购自Cornin公司。MightyAmpTM DNA Polymerase Ver.3购自TaKaRa公司。FITC anti-CD45 mAb、PE anti- CD3 mAb和PE/Cyanine7 anti-CD8 mAb购自BioLegend公司。

1.2实验方法

1.2.1 NMU基因敲除纯合子小鼠的获得

NMU基因敲除杂合子小鼠均于实验动物中心(SPF级),在室温24℃,湿度50%～70%,昼夜交替的条件下饲养，所有操作均符合实验动物伦理学要求(批准文号：KT2022424),采用雌雄2∶1的比例合笼进行扩繁，鉴定筛选纯系再进行繁殖，这个过程需要几代鼠完成，最终获得供实验用一定数量的NMU基因敲除纯合子小鼠。

1.2.2引物设计

根据NMU基因序列结构及结合敲除的位置，在第二个外显子处进行序列敲除并设计用于NMU基因敲除基因型鉴定的PCR扩增引物，设计引物依据(图1)。引物序列为：F3上游引物(forward)5'-GTTGGGACCATAACACTGCATTC-3',R3下游引物(reverse)5'-CATATCTTAATCACTACCCATGATG-3',450 bp; F3上游引物(forward)5'-GTTGGGACCATAACACTGCATTC-3',R4下游引物(reverse)5'-GTTGCCGATGAGTCACGCATTC-3',380 bp。

图1 NMU基因序列设计引物依据

Fig.1 Primer design basis for NMU gene sequence

1.2.3 NMU基因敲除鼠基因型鉴定方法

仔鼠离乳后，剪取鼠尾1～2 mm组织，用直接提取DNA与PCR扩增一步完成法的试剂盒检测，具体的操作方法参照试剂盒说明书。鼠尾组织的PCR扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，依照分析电泳图谱可以确定基因型：野生型、杂合型、纯合型。

1.2.4胰腺原位荷瘤

将培养生长期的Panc02细胞消化下来，预冷的PBS清洗后，缓慢混均于Matrigel基质胶中，全程冰上操作，调整细胞数为2×107。选取8～9周龄的小鼠，体重(20±2)g的C57BL/6 NMU基因敲除纯合子小鼠，麻醉状态下，固定好小鼠后，剔除腹部左侧皮毛，碘伏消毒手术部位，剪开左侧腹，找到胰腺组织，缓慢将20μL Panc02细胞悬液注入胰尾组，待基质胶凝固，缓慢拔出针头，手术缝合术后保暖，待苏醒完成肿瘤种植。

1.2.5制作冰冻切片及HE染色

荷瘤3周后，用颈椎脱位法处死小鼠，打开腹腔，获取胰尾肿瘤组织。胰尾肿瘤组织离体后，马上浸入4%多聚甲醛固定液中，4℃固定48 h以上。PBS浸洗3次，每次15 min,浸入20%蔗糖PBS缓冲液中脱水过夜。将组织块黏附在涂有OCT包埋剂的样品台上，制作5μm切片，切片所用的载玻片是经APES防脱处理的玻片，玻片平贴组织切片，室温放置30 min后，浸入4℃丙酮中固定10 min,室温干燥20 min,进行常规HE染色。

1.2.6生物信息学分析

登录GEPIA (http: //gepia.cancer-pku.cn/)网站，以 │Log2FC│值为2,P-value为0.01分析NMU在胰腺肿瘤患者数据(肿瘤179例，正常4例)中的差异表达程度、临床病理分期分析。以NMU表达中位值分类肿瘤患者数据，进行总生存期及无病生存期分析。登录CIBERSORTx(https: //cibersortx.stanford.edu/)网站，以NMU中位值分类，计算两分类之间肿瘤浸润性免疫细胞的表达变化。

1.2.7流式细胞术

荷瘤3周后，用颈椎脱位法处死小鼠，打开腹腔，获取小鼠脾组织。预冷PBS清洗2次，操作两个载玻片研磨脾组织，收集细胞悬液后裂解红细胞，重悬后调整细胞数为1×106/mL。每mL细胞悬液加入1μL兔抗鼠CD16/CD32抗体封闭，按照实验顺序依次加入流式抗体，4℃避光孵育30 min,洗涤细胞后经200目滤网后上机检测。

2、结果

2.1 PCR产物电泳成像识别基因型鼠

鼠尾组织利用特异性引物进行PCR扩增，其产物凝胶成像电泳图谱可以确定：野生型(只有F3和R4引物扩增出条带，380 bp)、杂合型(F3和R3引物及F3和R4引物均扩增出条带，分别为450 bp和380 bp)、纯合子型(只有F3和R3引物扩增出条带，450 bp)(图2-3)。

图2鼠尾组织PCR扩增产物的凝胶电泳图

图3纯合型鼠尾组织PCR扩增产物的电泳图

2.2成功构建胰腺原位荷瘤

基因敲除纯合子小鼠，胰尾组织种植Panc02细胞，荷瘤3周后，外观小鼠皮毛较正常鼠失去光泽，营养不良，精神萎靡，用颈椎脱位法处死小鼠，将小鼠固定在解剖台上，打开腹腔，获取胰尾肿瘤组织(图4)。

图4 NMU基因敲除小鼠正常胰腺组织、胰尾原位肿瘤

2.3肿瘤组织HE染色结果

HE染色是一种常用的组织学染色方法，它可以同时染色细胞核和细胞质，使得组织结构更加清晰可见。通过HE染色显微镜下可见：胰尾肿瘤细胞核和细胞质与正常细胞相比，形态更加不规则，细胞大小和形状不一，核仁明显，核与胞浆比例不均，细胞质形态异常，组织结构紊乱，细胞核大染色深，无核仁，细胞质浓缩，细胞排列紊乱，细胞间隙不规则，无明显的组织结构，有的形成团块状或腺管状结构等这些特点可以确定鼠荷瘤模型构建成功(图5)。

2.4生物信息学分析NMU是胰腺癌进展中的不良事件

NMU作为胆碱能神经元分泌的神经多肽，已被证实在多种肿瘤中发挥促瘤作用[2]。生物信息学分析发现，与正常胰腺组织相比，NMU在胰腺癌患者肿瘤组织内表达增多(图6A)。在临床病理分期研究中，胰腺癌在临床上分为四期(StageⅠ-Ⅳ),可以发现NMU的表达逐级递增，其中在StageⅠ向StageⅡ发展中显著增多，这提示在胰腺癌发生早期NMU就展现出了提示作用(图6B)。随后整理患者生存数据，进行总生存期及无病生存期分析，发现高表达NMU的患者生存时间较短，说明NMU介导着患者预后不良(图6C-D)。为研究NMU影响胰腺癌肿瘤微环境中免疫细胞的作用，使用CIBERSORT算法按照NMU表达水平中位值分类，并量化其与肿瘤浸润性免疫细胞亚群之间的表达相关性。结果发现NMU可降低CD8+T细胞、初始CD4+T细胞、γδT细胞和单核细胞的表达丰度，提高免疫抑制效应细胞Tregs的表达丰度，可见NMU可以促使肿瘤免疫微环境表现为免疫抑制状态(图6E)。根据生物信息学分析结果，加之成功建立C57BL/6NMU敲除纯合子小鼠胰腺原位肿瘤模型，为进一步探究胰腺癌进展中NMU具体发挥的效应机制，亦有助于发现新的胰腺癌免疫抑制机制及治疗靶点的研究。

图5 NMU基因敲除小鼠组织切片HE染色(×100)

2.5 NMU影响荷瘤小鼠全身免疫景观中CD8+T细胞丰度

肿瘤的形成伴随着浸润性T细胞功能的变化，尤其是肿瘤免疫微环境中CD8+T细胞不仅扮演着杀伤肿瘤细胞的重要作用，还决定了临床评估肿瘤免疫治疗的效果[3]。因此结合上述生物信息学分析结果，我们着重探究全身免疫景观中CD8+T细胞的丰度变化。流式细胞术结果表明，NMU的敲除导致肿瘤小鼠脾组织中CD8+T细胞百分比及绝对值增多(图7)。这提示我们，NMU作为胰腺癌进展中的不良事件可以影响免疫应答，有助于肿瘤的发生发展。

3、讨论

胰腺癌是消化系统恶性程度极高的肿瘤，胰腺癌的发生、发展、转移受到多种基因调控，其机制仍未完全阐明，早期临床诊断十分困难[4]。其中胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)是最常见的胰腺癌类型，约占胰腺癌病例的90%以上[5]。神经侵袭是胰腺的另一个突出特征，已被证明与胰腺癌患者的不良预后相关。研究显示在胰腺导管癌进展中，神经侵袭触发的胆碱能来源于神经元和周围神经胶质细胞的神经递质通过自分泌和/或旁分泌信号影响胰腺癌生长[6]。PDAC属于高度侵袭性的消化系统恶性肿瘤，深入研究PDAC恶性进展的分子机制，寻找新的有效治疗靶点，对于提高PDAC的早期诊断和指导临床治疗具有重要的临床意义[7]。

图6 NMU是胰腺癌发展中的不良事件介导免疫抑制性肿瘤微环境

图7 NMU影响荷瘤小鼠全身免疫景观中CD8+T细胞丰度

研究发现在乳腺癌、肺癌及结直肠癌发生过程中，肿瘤部位NMU表达水平升高且与患者预后不良呈正相关[8-10]。已有研究表明，YAP-1蛋白在胰腺癌内过表达可诱导NMU的表达和转录，通过上调上皮间充质化(EMT)促进胰腺癌发展与转移，YAP1-NMU轴可视为胰腺癌进展和不良预后的生物标志物[11]。NMU是由胆碱能神经元分泌的一种神经肽，属于神经介素家族，参与包括激活免疫细胞和诱导炎性细胞因子分泌在内的多种机体反应过程[12]。NMU存在两种不同的特异性结合受体，NMUR1和NMUR2,均属于G蛋白偶联受体A群[13]。G蛋白偶联受体是一类跨膜蛋白，它能够感知外界的信号，并通过细胞内信号转导途径传递这些信号，从而调控细胞的生理功能[14]。研究显示NMUR1主要分布于外周组织脏器，而NMUR2则主要在中枢神经系统发挥作用[15]。生物信息学分析表明，与正常胰腺组织相比，NMU在胰腺癌患者肿瘤组织内表达增多。在临床病理分期研究中，提示在胰腺癌发生早期NMU就展现出了提示作用，发现高表达NMU的患者生存时间较短，说明NMU介导着患者预后不良。在肿瘤发生发展过程中，T细胞浸润被视为影响肿瘤生长的真正调节剂，通过输注T细胞产物或抗体介导的T细胞检查点来锁定肿瘤免疫治疗状态[16]。结合前期的研究，我们发现NMU基因敲除后小鼠脾组织内CD8+T细胞表达增多，肿瘤免疫抑制状态得到缓解。此外，我们还观察到C57BL/6 NMU基因敲除小鼠荷瘤3周后，经颈椎脱位法处死小鼠，手术打开腹腔，获取60例胰尾肿瘤组织时，肉眼可见肝转移肿瘤5例，组织发生转移肿瘤情况有待于进一步探讨。C57BL/6 NMU基因敲除小鼠荷瘤3周后，用颈椎脱位法处死小鼠，打开腹腔，获取60例胰尾肿瘤组织时，肉眼可见肝转移肿瘤5例，组织发生转移肿瘤情况有待于进一步探讨。

综上所述，因胰腺癌的隐匿发病，恶性程度高、早期诊断困难且易转移，患者生存率很低，预后差[17],使研究者无法及时获取胰腺癌早期病例进行深入研究，成功构建C57BL/6 NMU基因敲除小鼠胰腺原位肿瘤模型，利用生物信息学分析结果，有待于研究者进行深入探究和验证NMU在胰腺肿瘤中表达的相关性，为研究胰腺癌发生发展的分子机制并寻找新的免疫治疗策略，提供前提基础。

基金资助:沈阳医学院大学生科研项目(编号:20249080);

文章来源:郑瑞,潘旭亿,弓紫萱,等.NMU基因敲除鼠胰腺原位荷瘤模型的构建及研究意义[J].现代肿瘤医学,2024,32(22):4273-4277.