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肾脏雄激素调节蛋白在小鼠肾纤维化进展中作用的初步研究

2021-10-07 106 上传者：管理员

摘要：目的:初步研究肾脏雄激素调节蛋白(KAP)在单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠肾纤维化进展中的作用。方法:我们首先在基因表达综合数据库(GEO)下载GSE62732小鼠肾纤维化模型芯片,利用Limma函数包筛选出差异基因;然后通过手术结扎C57小鼠单侧输尿管构建UUO小鼠肾纤维化模型;进一步通过免疫组化和蛋白免疫印迹实验检测上述模型中KAP的表达情况。结果:在GSE62732小鼠肾纤维化模型中筛选获得了差异基因KAP;成功构建了本实验的UUO肾间质纤维化小鼠模型;免疫组化及蛋白免疫印迹实验均发现本实验UUO小鼠肾纤维化模型中KAP蛋白表达水平明显升高。结论:KAP在UUO小鼠肾纤维化模型中的表达水平升高。

关键词：
肾功能
肾纤维化
肾脏雄激素
调节蛋白
输尿管梗阻
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肾纤维化包括肾间质纤维化(细胞外基质过度积聚，肾小管间质成纤维细胞增殖及炎性细胞浸润)、肾小球硬化、肾内血管硬化等[1]。既往研究表明，肾间质纤维化程度与患者肾功能更为相关，是反应患者肾功能下降严重程度以及判断预后的主要指标[2]。目前肾间质纤维化的发病机制尚不十分明确，可能的机制有肾间质成纤维细胞活化与增殖、肾小管间质细胞的活化、炎症介质释放及炎症细胞浸润、细胞外基质转换失平衡、肾组织局部缺氧缺血等[3]。其发生发展还受多种致病因素的影响，其中包括一些损害如阻塞性机械损伤、药物的化学毒性和缺血再灌注损伤等，导致了肾脏的基因表达的改变，是肾纤维化发病的内在机制[4]。近年来，随着高通量测序技术的快速发展和大数据库的建立，为我们分析基因功能提供了极大的方便，人们对基因组水平的肾纤维化机制也进行了越来越多的探索[5]。本研究从基因表达综合数据库中分析GSE62732小鼠肾纤维化模型芯片入手，筛选出了相关差异基因KAP,并初步探究相关差异基因KAP在UUO小鼠肾纤维化模型的作用。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1GSE62732

小鼠肾纤维化模型芯片从GEO数据库下载。

1.1.2实验动物

试验所用雄性C57BL/6小鼠(20～25g,10周龄)从三峡大学实验动物中心购买，饲养温度(23±2)℃,光暗循环12h/12h,均可自由获得食物和水。所有的动物在进行任何实验前，均适应环境1个星期，且本研究方案已经获得三峡大学福利和伦理委员会批准。

1.1.3试剂

兔抗人肾脏雄激素调节蛋白单克隆抗体、兔抗人β-肌动蛋白(β-actin)多克隆抗体均购于Abcam公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司。

1.1.4仪器

常温离心机(DICO17);电泳仪BIO-RAD;脱色摇床(TS-8S);显微镜(CKX41);全自动化学发光图像分析系统(Tanon-5200)。

1.2方法

1.2.1单侧输尿管梗阻(UUO)模型构建

按随机数字法将雄性小鼠随机分为UUO小鼠模型组和对照组各10只，UUO小鼠模型组用4%的水合氯醛麻醉小鼠(0.20mL/20g),通过腹部切口暴露左侧输尿管，用5-0丝线结扎并离断，引起完全梗阻，逐层缝合切口后继续饲养，对照组术中仅游离左侧输尿管，不做结扎。手术后14d获得上述小鼠肾脏组织。

1.2.2苏木精伊红、MASSON染色

取出的左肾组织，以10%中性福尔马林固定，经脱水、包埋、切片，2μm厚石蜡片作苏木精伊红、MASSION染色。光镜下通过形态学比较、纤维组织染色，以证实肾纤维化模型构建是否成功。

1.2.3免疫组化

通过上述步骤获得小鼠左肾组织进行石蜡包埋，然后将石蜡包埋的组织依次经过以下步骤：石蜡切片→水化→血清封闭→Ⅰ抗孵育→Ⅱ抗孵育→加底物→显色→复染→封片(具体操作见KAP免疫组化试剂说明书)。在每张免疫组化染色片中，选取10个不重叠视野(×400),拍照。使用Imageproplus软件分析阳性着色区域并统计出OD值，并用prism作图对KAP表达水平进行评价。

1.2.4蛋白免疫印迹实验

使用含1%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解小鼠肾组织匀浆，提取总蛋白。取20μg的各组待测样品及4uL蛋白的Marker上样，一次进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，转模，封闭，用KAP和β-actin一抗抗体(1:500)在4℃条件下孵育过夜。孵育二抗(1:1000)1h,用ECL蛋白显影液曝光并拍照记录。用Gelproanalyser对蛋白条进行分析并统计数据并用prism作图。

1.3统计学方法

采用SPSS20.0统计软件进行分析，符合正态分布的计量资料以x¯±s表示，两组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

KAP在GSE62732小鼠肾纤维化模型中差异性表达。我们首先在GEO下载GSE62732小鼠肾纤维化模型芯片，利用Limma函数包筛选并做热图分析出差异基因KAP(图1)。

UUO小鼠肾纤维化模型构建成功。相比于假手术组小鼠肾组织，UUO组镜下可见肾小管明显扩张，小管间出现大量红细胞，管状上皮有不同程度的坏死及脱落，组织内广泛炎性细胞浸润(图2a、b),提示肾组织损伤严重；于是我们用MASSON染色，UUO组镜下可见广泛肾小管间质区域蓝染，提示胶原纤维组织形成(图2c、d)。

KAP在UUO组高表达。通过对小鼠肾组织的HE和MASSON染色证明了我们的UUO小鼠模型构建成功，为了探究KAP在我们构建的UUO小鼠模型表达情况，我们用免疫组化的方法检测了小鼠肾脏组织的KAP表达，并采用Imageproplus对免疫组化图片分析，我们发现免疫组化提示KAP在UUO组高表达，且与对照组差异有统计学意义(P<0.05),见图3、4。

蛋白免疫印迹证实KAP在UUO组中高表达。在免疫组化中，我们发现KAP在UUO组高表达，于是我们进一步使用蛋白免疫印迹实验检测KAP蛋白的表达量，通过Gelproanalyser对蛋白条带的分析，我们发现UUO组中的KAP表达量明显上升，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图5、6。

3、讨论

KAP是由肾近曲小管上皮细胞特异性分泌的一种由雄激素调节控制的蛋白[6]。近年来，比较多的研究印证了KAP基因的表达与动脉粥样硬化、高血压肾病、糖尿病肾病有关，这些疾病的终末病理改变均为肾纤维化[7]。此外，在肾后性梗阻肾纤维化模型中，肾组织微缺氧环境、炎症反应、上皮细胞损伤，以及一些细胞因子如促纤维化因子的作用，被认为是肾纤维化的重要因素[8,9]。

雄激素被认为可以影响血压调节，当雄激素和功能性雄激素受体存在时，KAP是肾近曲小管中表达最丰富和特异的基因。在缺乏外源雄激素刺激的情况下，转基因雄性小鼠肾特异性KAP高表达可导致与氧化应激增加相关的高血压[10]。其机制为：氧化应激反应损伤血管内皮功能、诱发血管收缩、激活局部RAS,增加出球小动脉阻力，造成肾小球内滤过压的升高，发生肾血管硬化。此外，KAP可能参与了高血压肾病的发生和进展，在高脂饮食诱发的动脉硬化小鼠模型尿液中出现KAP、Ⅰ型胶原蛋白、上皮生长因子等典型动脉硬化相关蛋白的高表达[11]。这些都提示KAP基因的表达与动脉硬化、高血压肾病有关，是导致终末肾脏病肾纤维化的因素，这与我们UUO小鼠肾纤维化模型中KAP蛋白表达升高的结果是一致的，故我们推测当肾组织损伤严重、组织内广泛炎性细胞浸润、肾小管间质区胶原纤维组织大量形成时，KAP表达会升高。

此外Tornavaca等[12]在一项KAP介导高血压和肾脏疾病的研究中，通过对KAP转基因(KAP高表达)小鼠和对照组小鼠血压观察以及氧化应激相关因子的检测，发现在KAP转基因小鼠中更容易出现高血压，且小鼠表现出局部节段性肾小球硬化、蛋白尿、糖尿和纤维化等肾脏缺陷。在本研究中检测也发现KAP在我们构建的UUO小鼠肾纤维化模型表达也明显升高，这些结果与Tornavaca等[12]的结论也是相一致的，进一步证明了他们的结论。