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和厚朴酚调控Klotho改善顺铂诱导小鼠急性肾损伤的研究

2023-10-12 164 上传者：管理员

摘要：探讨和厚朴酚对顺铂诱导小鼠急性肾损伤的影响及机制。方法将40只Balb/C小鼠随机分为对照组(30%PEG400)、模型组(20 mg•kg-1顺铂+30%PEG400)、低、中、高剂量实验组(10、20、40 mg•kg-1和厚朴酚腹腔注射),每组8只。各组均分别连续5 d腹腔注射相应试剂，每日1次。给药第3天时，除对照组予以0.9%NaCl外，其余各组均单次腹腔注射顺铂20 mg•kg-1建立肾毒性小鼠模型。以酶联免疫检测法测定血清肌酸酐(SCr)、尿素氮(BUN),用肾组织匀浆法测定丙二醛(MDA)水平；用蛋白质印迹法检测Klotho、B-细胞淋巴瘤2相关X蛋白(Bax)、B-细胞淋巴瘤因子2蛋白(Bcl-2)、线粒体超氧化物歧化酶蛋白2(SOD2)的表达水平。

关键词：
Klotho基因
化疗药物
和厚朴酚
急性肾损伤
顺铂
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顺铂(cisplatin, CP)是一种高效化疗药物，但因易在近端肾小管上皮细胞中积累，激活凋亡、诱导氧化应激及线粒体损伤，导致严重的肾毒性，而成为药物性急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)常见致病原因[1,2]。Klotho最初以抗衰老基因被熟知，在肾小管组织高表达，具抗炎[3]、抗氧化应激[4]、抗凋亡等活性。研究发现，Klotho基因的过表达或重组Klotho蛋白注射在多种肾疾病模型中具有保护作用[5]。因此，增加内源性Klotho水平可能是治疗药物性AKI的新策略。和厚朴酚(honokiol, HKL)为中药厚朴的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化、中枢性肌肉松弛等作用[6],但其对顺铂诱导AKI的作用仍不明确。本研究考察和厚朴酚对顺铂诱导AKI小鼠的影响，并从Klotho的角度探讨其机制，以期为和厚朴酚改善顺铂肾毒性的应用提供依据。

1、材料与方法

1材料

动物40只SPF雄性Balb/C小鼠，鼠龄8～10周，购自广州中医药大学实验动物中心。动物生产许可证号：SCXK(粤)2018-0002。本实验经广州中医药大学中药学院实验动物伦理委员会批准(伦理

批号：ZYD-2021-155)。

药物与试剂和厚朴酚，规格：每瓶1 g,含量：≥98%,批号：H111272,顺铂，规格：每瓶250 mg,批号：D2003021,均购自阿拉丁试剂有限公司。尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)测试盒、肌酸酐(serum creatinine, SCr)检测盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)检测盒，均购自南京建成生物公司；一步法原位末端标记法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒(绿色荧光),购自上海碧云天生物公司；线粒体超氧化物歧化酶蛋白(superoxide dismutase 2,SOD2)一抗、Klotho一抗，均购自美国Abcam公司；B细胞淋巴瘤2相关X蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X protein, Bax)一抗，均购自美国CST公司；B-细胞淋巴瘤因子2蛋白(B cell lymphoma-2,Bcl-2)一抗，购自上海艾比玛特医药科技有限公司；兔二抗(HRP-linked anti-rabbit IgG)、鼠二抗(HRP-linked anti-mouse IgG),均购自美国Jackson Immuno Research公司。

仪器Multiskan GO 1510全波长酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific公司产品；PowerPac Basic双垂直电泳仪，美国Bio-Bad公司产品；5200CE化学发光成像系统，上海天能科技有限公司产品；BX53BX53荧光显微镜，日本Olympus公司产品。

2、实验方法

2.1模型建立

按照文献[7]报道的方法进行操作，小鼠单次腹腔注射20 mg·kg-1顺铂建立肾毒性模型。

2.2动物分组与给药方法

将实验动物随机分成对照组、模型组和低、中、高剂量实验组(10、20、40 mg·kg-1和厚朴酚),每组8只。各剂量实验组按预定剂量腹腔注射，对照组与模型组分别注射相应体积的溶剂(30% PEG400),每日1次，给药5 d。给药第3天时，除对照组予以0.9%NaCl外，其余各组均按“2.1”造模。

2.3样本采集

第5天末次给药后1 h,小鼠眼眶取血，离心分离血清，-20℃保存。颈椎脱臼法处死动物，剖腹取双侧肾，分别予以多聚甲醛固定或液氮冻存。

2.4以酶联免疫检测法测定SCr与BUN的含量[8]8]

取冰箱中冻存的血清，按照相应试剂盒说明书中的操作步骤进行处理，用酶标仪检测SCr与BUN水平。

2.5用肾组织匀浆法测定MDA含量[9]9]

取冰箱中冻存的组织制备成10%组织匀浆，按照相应试剂盒说明书中的操作步骤进行处理，用酶标仪检测MDA水平。

2.6用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining, HE)染色法观察小鼠肾组织病理形态[10]10]

多聚甲醛固定肾组织样本48 h后，经梯度乙醇脱水，石蜡包埋、切片等步骤，HE染色，在光学显微镜下观察各组小鼠肾组织病理形态情况。

2.7用TUNEL染色法观察小鼠肾组织细胞凋亡情况[11]11]

取各组石蜡切片白片按照TUNEL检测试剂盒的说明书进行操作。荧光显微镜记录荧光图像，与细胞核可重合的绿色荧光亮点即为凋亡细胞。

2.8用蛋白质印迹法检测小鼠肾组织中蛋白的表达水平[12]12]

用蛋白质印迹法检测各组小鼠Klotho、Bax、Bcl-2、SOD2表达，以12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，转移至聚偏二氟乙烯膜。5%脱脂牛奶室温摇床封闭蛋白2 h后，分别按照相应抗体建议稀释浓度加入各自一抗，于4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜3次，每次5 min。再加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5 000),室温孵育1 h。TBST洗膜后，电化学发光显示条带，拍照后用Image J软件对目的条带进行半定量分析。

3、统计学处理

用SPSS 21.0软件进行统计分析。结果用

表示。符合正态分布与方差齐性的多组资料用单因素方差分析(One-way ANOVE)检验。用GraphPad 8.0软件作图。

2、结果

1和厚朴酚对顺铂诱导AKI小鼠BUN、SCr水平的影响

对照组给予30%PEG400;模型组给予20 mg·kg-1顺铂+30%PEG400;低、中、高剂量实验组分别给予10、20、40 mg·kg-1和厚朴酚腹腔注射。

模型组与对照组比较，小鼠血清BUN、SCr水平均显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.01);各剂量实验组与模型组比较，小鼠血清BUN、SCr均显著下降，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01),见表1。

2和厚朴酚对顺铂诱导AKI小鼠肾组织病理学的影响

HE染色结果如图1所示。对照组小鼠肾小管上皮细胞轮廓较清晰，胞核完整。模型组小鼠肾小管上皮细胞空泡化，严重处可见玻璃体样变性、坏死。局部肾小管上皮细胞胞核固缩，蛋白在肾小管内积聚形成透明管状。与模型组比较，各剂量实验组肾小管上皮细胞变性、坏死及小管管型均有减少，提示其对顺铂诱导的肾小管损伤病理学改变具有减轻作用。

3和厚朴酚对顺铂诱导AKI小鼠凋亡的影响

对照组、模型组和低、中、高剂量实验组小鼠的肾组织Bax/Bcl-2比值分别为1.05±0.17、1.84±0.06、1.23±0.20、0.96±0.12和0.79±0.23。模型组与对照组比较，Bax/Bcl-2蛋白相对表达水平比值显著升高，差异有统计学意义(P<0.01);各剂量实验组与模型组比较，Bax/Bcl-2比值均显著下降，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。如图2所示，与对照组相比，模型组小鼠肾组织中可见明显细胞凋亡绿色荧光，细胞核则呈蓝色荧光；与模型组比较，低、中、高剂量实验组绿色荧光明显减少，表明和厚朴酚可抑制顺铂诱导AKI小鼠肾组织凋亡。

表1和厚朴酚对顺铂诱导的急性肾损伤(AKI)小鼠血清尿素氮(BUN)、肌酸酐(SCr)的影响

4和厚朴酚对顺铂诱导AKI小鼠肾组织Klotho表达的影响

对照组、模型组和低、中、高剂量实验组的Klotho蛋白相对表达水平分别为1.07±0.13、0.70±0.11、0.91±0.08、1.09±0.11和1.22±0.06。模型组与对照组相比，小鼠肾组织Klotho蛋白相对表达水平显著下降，差异有统计学意义(P<0.05);中、高剂量实验组与模型组比较，Klotho相对表达水平均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。这表明调控Klotho可能是和厚朴酚减轻顺铂诱导小鼠急性肾损伤的重要环节。

5和厚朴酚对顺铂诱导的AKI小鼠氧化应激的影响

模型组与对照组相比，小鼠MDA水平显著升高，SOD2蛋白表达水平显著下降，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);各剂量实验组与模型组比较，MDA水平均显著下降，差异均有统计学意义(均P<0.01);中、高剂量实验组与模型组比较，SOD2蛋白表达水平均显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01),见表2。

表2和厚朴酚对顺铂诱导的AKI小鼠肾组织(MDA)水平和超氧化物歧化酶蛋白(SOD2)蛋白的影响

3、讨论

顺铂为当前化疗中最常用的药物之一，其抗瘤谱广、作用强[13],但易积聚于肾，造成肾毒性。在用顺铂进行化疗的患者中，AKI发生率可达15%～30%,且可随后续应用而增加，最终引起不可逆的肾慢性病变。因此，针对其损伤机制及其干预药物的探索值得关注[14]。

和厚朴酚是厚朴的主要有效成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老等多种药理作用。本研究结果发现，给予顺铂可致小鼠SCr和BUN升高，HE染色可见肾小管上皮细胞变性、管型，而和厚朴酚干预可改善顺铂诱导AKI小鼠的肾功能，减轻其病理损伤。

Klotho是一种主要在肾表达的抗衰老基因，其编码的Klotho蛋白与肾病关系密切。HU等[15]研究发现，AKI大鼠血、尿和肾组织中Klotho明显下降，且给予Klotho可促进损伤修复。Klotho缺陷小鼠发生AKI时损伤较重，而过表达Klotho小鼠则AKI病变较轻，提示Klotho蛋白水平可能有助于保护肾功能。本课题组研究发现，顺铂可诱导小鼠肾组织Klotho下调，而和厚朴酚则上调Klotho水平，提示其可能通过调控Klotho减轻顺铂诱导的小鼠AKI。

尽管顺铂诱导AKI的机制复杂，但氧化应激和凋亡均为其重要环节。研究发现，Klotho参与氧化应激和凋亡的调控，小鼠肾小管上皮细胞Klotho蛋白表达降低可加重氧化应激损伤和凋亡，而Klotho过表达可逆转其抗氧化酶丢失，进而减轻氧化损伤和细胞凋亡[16,17,18]。本课题组研究发现，和厚朴酚可减少TUNEL染色绿色荧光，下调Bax/Bcl-2比值，增加SOD2表达，减少MDA堆积，提示其可能通过上调Klotho,改善顺铂诱导AKI小鼠的氧化应激与凋亡。

参考文献:

[6]张明发，沈雅琴.和厚朴酚抗膀胱癌、皮肤癌和骨肉瘤的药理作用及其机制的研究进展[J].抗感染药学，2022,19(8)1102-1106.

[8]高欢.奥美拉唑对顺铂诱导肾损伤的保护作用及机制研究[D].吉林长春:吉林大学，2019.

[9]席加喜，刘晓霞，杨玉芳，等.血栓通对顺铂肾损伤大鼠的肾功能和氧化指标的影响[0].中国实验方剂学杂志，2012,18(10):263-266.[10]李红莲，周桔，林华，等.丹酚酸B通过抗炎、抗氧化和促进自噬减轻慢性肾小球肾炎的肾功能损伤[J.中药药理与临床，2019,35(5):34-38.

文章来源:殷思敏,王思怡,黄东升等.和厚朴酚调控Klotho改善顺铂诱导小鼠急性肾损伤的研究[J].中国临床药理学杂志,2023,39(19):2798-2802.