慢性肾病(chronic kidney disease, CKD)可损害肾功能，给全世界患者及家人带来巨大的经济负担，但每年仍约有8%～16%的患者被诊断为CKD[1]。研究表明，铁死亡参与了多种疾病的发生和发展包括肿瘤发生、缺血再灌注损伤、脑和神经疾病以及肾疾病[2]。研究发现，铁死亡参与脓毒症相关的急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)的发展，且核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)对铁死亡的调节至关重要。Nrf2上游因子-沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)作为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性组蛋白脱乙酰酶家族成员之一，是细胞代谢、衰老、凋亡、炎症反应和氧化应激等多种过程中的关键调节因子[3]。虾青素(astaxanthin, AST)具有抗氧化和抗炎作用[4],但能否通过SIRT1/Nrf2信号通路影响AKI报道较少。因此，本研究旨在探讨AST通过SIRT1/Nrf2信号通路对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的肾小管上皮细胞铁死亡的影响。

1、材料与方法

1材料

细胞 人肾小管上皮细胞(HK-2),购自美国ATCC公司。

药品与试剂AST,规格：每瓶50 mg,纯度：≥97% (HPLC);LPS,规格：1 mg/25 mL,批号：100162,均购自美国Sigma-Aldrich公司；烟酰胺(SIRT1抑制药),规格：每瓶10 g,批号：,购自百奥莱博科技有限公司。细胞计数试剂盒8(cell-counting kit-8, CCK-8)试剂盒，购自上海生工公司；胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，均购自碧云天生物公司；铁离子检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；逆转录酶试剂盒，购自日本Takara公司；SIRT1、Nrf2、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、非糖基化的xCT(glutamate antiporter solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)抗体，均购自美国Abcam公司。

仪器VICTOR Nivo酶标仪，美国PerkinElmer公司产品；Attune CytPix成像型流式细胞仪，美国Invitrogen公司产品。

2实验方法

2.1细胞培养[5]5]

HK-2细胞并置于含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，培养在37℃和5% CO2培养箱中。

2.2细胞分组及处理[6]6]

当HK-2细胞生长融合达到70%～80%时，进行传代，实验使用第3代至第5代HK-2细胞。随后将细胞分为对照组、溶剂组、LPS组、AST组、AST+烟酰胺组。LPS组：将1μg·mL-1LPS添加到培养的细胞中，以建立LPS诱导的AKI的HK-2细胞模型；AST组：以1μg·mL-1 LPS、20μmol·L-1 AST处理细胞[7];AST+烟酰胺组：以1μg·mL-1 LPS、20μmol·L-1 AST、20 mmol·L-1烟酰胺处理细胞[7];溶剂组：以0.1%的二甲基亚砜进行处理；对照组：不作任何处理。

2.3以CCK-8法检测细胞活力

在进行各组处理之前，参考文献[8]步骤，将HK-2细胞添加到96孔板中，每孔6×103个细胞的密度并孵育48 h。处理细胞，每孔加入CCK-8溶液10μL,再培养3 h。通过酶标仪在450 nm处测量光密度值，分析细胞活力。

2.4以流式细胞仪检测细胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平

将细胞接种在6孔板中，参考文献[9]步骤，按照“2.2”中操作进行分组处理后，加入荧光探针DCFH-DA 1 mL,培养30 min后，洗去多余DCFH-DA,收获细胞，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)洗涤2次，悬浮在PBS 500μL中。通过流式细胞仪分析ROS表达。

2.5以ELISA实验检测GSH-Px、MDA、铁离子水平

收集各组细胞，离心取上清液，参考文献[9]步骤，按照各自试剂盒说明书检测细胞上清液中GSH-Px、MDA、铁离子水平。

2.6以实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, qRT-PCR)检测铁死亡标志SLC7A11、GPX4 mRNA表达水平

用TRIzol试剂提取HK-2细胞的总RNA,参考文献[10]步骤，检测RNA的浓度和纯度，使用逆转录酶试剂盒从RNA逆转录为cDNA,以总RNA 100 ng作为qPCR的模板。将GAPDH用作SLC7A11、GPX4的内部参考基因。结果以2-ΔΔCt进行分析。

2.7以蛋白质印迹(Western blot)法检测SIRT1、Nrf2、GPX4、SLC7A11蛋白表达水平

使用RIPA裂解缓冲液和超声处理裂解细胞，并通过增强型BCA蛋白浓度测定试剂盒测量细胞裂解液的总蛋白浓度，然后对总蛋白质30μg进行蛋白质印迹。参考文献[10]步骤，将蛋白质样品上样SDS-PAGE上，之后转膜，牛奶封闭2 h,将一抗在4℃下孵育过夜。二抗孵育后，对蛋白条带进行可视化。使用Image J软件进行定量各蛋白。

3统计学处理

用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析，以x¯±s

表示计量资料，多组间比较采用单因素方差分析，进一步行SNK-q检验。

2、结 果

1 AST对HK-2细胞活力的影响

LPS组：将1μg·mL-1LPS添加到培养的细胞中，以建立LPS诱导的AKI的HK-2细胞模型；AST组：以1μg·mL-1 LPS、20μmol·L-1 AST处理细胞；AST+烟酰胺组：以1μg·mL-1 LPS、20μmol·L-1 AST、20 mmol·L-1烟酰胺处理细胞[7];溶剂组：以0.1%的二甲基亚砜进行处理；对照组：不作任何处理。

对照组、溶剂组、LPS组、AST组、AST+烟酰胺组细胞活力分别为(100.00±0.00)%、(94.27±4.44)%、(39.62±3.97)%、(69.09±6.91)%和(40.51±4.06)%,溶剂组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05),LPS组较对照组降低(P<0.05);AST组较LPS组显著增加(P<0.05);AST+烟酰胺组较AST组显著降低(P<0.05)。

2 AST对HK-2细胞ROS水平的影响

对照组、溶剂组、LPS组、AST组、AST+烟酰胺组ROS表达分别为(216.33±21.64)%、(235.14±23.52)%、(1 899.34±189.94)%、(549.32±54.94)%和(1 216.23±121.63)%,溶剂组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05),LPS组较对照组显著增加(P<0.05),AST组较LPS组显著降低(P<0.05);AST+烟酰胺组较AST组显著增加(P<0.05),见图1。

3 AST对HK-2细胞上清液铁离子含量的影响

对照组、溶剂组、LPS组、AST组、AST+烟酰胺组铁离子分别为(2.74±0.28)、(3.04±0.31)、(16.72±1.68)、(8.41±0.85)和(14.26±1.43)ng·mL-1,溶剂组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05),LPS组较对照组增加(P<0.05),AST组较LPS组显著降低(P<0.05),AST+烟酰胺组较AST组显著增加(P<0.05)。

图1各组HK-2细胞活性氧(ROS)

4 AST对HK-2细胞上清液GSH-Px、MDA含量的影响

对照组、溶剂组、LPS组、AST组、AST+烟酰胺组MDA水平分别为(6.63±0.67)、(6.75±0.68)、(15.82±1.59)、(9.09±0.91)和(13.96±1.40)ng·mL-1,溶剂组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05),LPS组较对照组显著增加(P<0.05),AST组较LPS组显著降低(P<0.05),AST+烟酰胺组较AST组显著增加(P<0.05);各组GSH-Px水平分别为(11.63±1.17)、(11.82±1.19)、(4.25±0.43)、(8.34±0.84)和(5.16±0.52)ng·mL-1,溶剂组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05),LPS组较对照组显著降低(P<0.05);AST组较LPS组显著增加(P<0.05);AST+烟酰胺组较AST组显著降低(P<0.05)。

5 AST对HK-2细胞铁死亡标志SLC7A11、GPX4 mRNA表达水平

对照组、溶剂组、LPS组、AST组、AST+烟酰胺组SLC7A11 mRNA表达分别为1.01±0.11、0.98±0.10、0.34±0.04、0.83±0.09和0.44±0.01,GPX4 mRNA表达分别为1.04±0.11、1.03±0.11、0.52±0.06、0.87±0.09和0.56±0.06,上述指标，溶剂组与对照组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05),LPS组较对照组均显著降低(均P<0.05),AST组较LPS组均显著增加(均P<0.05),AST+烟酰胺组较AST组均显著降低(均P<0.05)。

6 AST对HK-2细胞SIRT1、Nrf2、GPX4、SLC7A11蛋白表达水平的影响

与对照组相比，溶剂组SIRT1、Nrf2、GPX4、SLC7A11蛋白表达均无统计学意义(均P>0.05),LPS组SIRT1、Nrf2、GPX4、SLC7A11蛋白表达较对照组均显著降低(均P<0.05);与LPS组相比，AST组SIRT1、Nrf2、GPX4、SLC7A11蛋白表达均显著增加(均P<0.05);与AST组相比，AST+烟酰胺组SIRT1、Nrf2、GPX4、SLC7A11蛋白表达均显著降低(均P<0.05),见表1。

表1 HK-2细胞中沉默信息调节因子1(SIRT1)、核因子E2相关因子2(Nrf2)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、非糖基化的xCT(SLC7A11)蛋白表达的比较(x¯±s)

3、讨 论

LPS可诱导细胞损伤并促进肾中炎症因子释放及氧化应激反应，与脓毒症相关的AKI相关[11]。本研究通过LPS诱导HK-2细胞建立AKI模型，进而探究AKI的发病机制及治疗方案。

最新研究表明，AST可抑制炎症因子及ROS的产生，进而减轻碘海醇诱导的HK-2细胞损伤[12]。徐洋等[7]研究表明，AST可通过激活碘海醇诱导的HK-2细胞中SIRT1表达，降低细胞凋亡，保护碘海醇诱导的细胞损伤。本研究结果显示，LPS诱导HK-2细胞中细胞活力、GSH-Px含量显著降低，MDA、ROS水平明显增加，提示LPS诱导HK-2细胞受到氧化应激损伤。但经AST干预后，上述指标得到逆转，HK-2细胞氧化应激损伤得到缓解，表明AST可对LPS诱导HK-2细胞发挥保护作用。

铁死亡是最近发现的一种非胱天蛋白酶依赖性程序性细胞死亡形式，其机制主要涉及细胞内ROS的积累导致脂质过氧化。GPX4、SLC7A11被认为是铁死亡的重要标志，其表达降低可能会产生大量的ROS,产生MDA,降低GSH-Px含量，引发细胞毒性[13]。SIRT1是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性组蛋白脱乙酰酶，是细胞抵抗氧化应激损伤的保护剂，可通过介导下游因子Nrf2表达消除脂质过氧化并增强氧化损伤抵抗力，在肝损伤、代谢和心脏病中发挥作用[14]。WANG等[14]研究表明，乌司他丁通过SIRT1/NRF2/HO-1通路减轻铁死亡，预防对乙酰氨基酚诱导的肝损伤。本研究结果显示，LPS组GPX4、SLC7A11、SIRT1、Nrf2表达降低，铁含量增加，提示SIRT1/Nrf2信号通路被抑制可诱导铁死亡，引发AKI损伤。经AST干预后，铁含量降低，GPX4、SLC7A11、SIRT1、Nrf2表达增加，氧化应激损伤得到缓解，推测AST通过激活SIRT1/Nrf2信号通路抑制铁死亡，改善LPS诱导HK-2细胞损伤。为验证上述推测，实验引入SIRT1抑制药-烟酰胺，结果显示烟酰胺逆转了AST对LPS诱导HK-2细胞的保护作用。结果表明，AST改善LPS诱导的HK-2细胞损伤，可能与激活SIRT1/Nrf2信号通路，抑制铁死亡有关。

AST可能通过激活SIRT1/Nrf2信号通路，抑制铁死亡，发挥对LPS诱导HK-2细胞损伤的改善作用，但该实验仅在体外进行，存在一定的不足，后续将进一步开展动物体内实验。

参考文献:

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文章来源:孔春艳,李纪华,王艳丽.虾青素对脂多糖诱导的肾小管上皮细胞铁死亡的影响[J].中国临床药理学杂志,2023,39(21):3092-3096.