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穗花杉双黄酮对鼻咽癌细胞恶性生物学行为影响

2023-11-24 81 上传者：管理员

摘要：目的研究穗花杉双黄酮(AF)调节Ras/Raf/促分裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路对鼻咽癌(NPC)细胞恶性生物学行为的影响。方法将NPC细胞株CNE-1随机分为对照组、低浓度AF组(AF-L组，50μmol•L-1 AF)、中浓度AF组(AF-M组，75μmol•L-1 AF)、高浓度AF组(AF-H组，125μmol•L-1 AF)和高浓度AF+Ras激活剂RASAL1组(AF-H+RASAL1组，125μmol•L-1 AF+2 ng•mL-1 RASAL1)。以噻唑蓝(MTT)实验检测细胞增殖能力；以划痕愈合实验检测细胞迁移能力；以Transwell实验检测细胞侵袭能力；以流式细胞术检测细胞凋亡率；以蛋白质印迹法检测细胞中Ras/Raf/MEK/ERK信号通路相关蛋白表达。结果对照组、AF-M组、AF-H组CNE-1细胞OD490值(48 h)为0.62±0.06、0.45±0.05、0.29±0.03;细胞划痕愈合率为(38.66±4.07)%、(23.14±2.20)%、(12.47±1.15)%;细胞侵袭数目为(137.59±10.25)、(103.42±8.49)、(76.38±7.96)个；Ras蛋白表达水平分别为0.84±0.08、0.59±0.06、0.34±0.03;Raf蛋白表达水平分别为0.79±0.08、0.53±0.05、0.24±0.02;MEK蛋白表达水平分别为0.87±0.09、0.64±0.06、0.28±0.03;ERK1/2磷酸化水平分别为0.75±0.08、0.50±0.05、0.21±0.02;细胞凋亡率分别为(4.25±0.63)%、(18.42±2.10)%、(35.28±2.26)%,以上指标，AF-M组、AF-H组与对照组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。RASAL1减弱了AF对NPC细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，抑制了其凋亡。结论 AF可能通过下调Ras/Raf/MEK/ERK信号通路抑制NPC细胞增殖、迁移和侵袭，促进其凋亡。

关键词：
Ras/Raf/促分裂原活化蛋白激酶激酶/细胞外信号调节激酶信号通路
侵袭
增殖
穗花杉双黄酮
迁移
鼻咽癌
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鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是发生在鼻咽黏膜的恶性肿瘤之一，世界范围内发病率较高[1]。目前，临床主要采用放疗来治疗早期鼻咽癌患者，而对于中晚期鼻咽癌患者，常采用放疗联合化疗的方式。穗花杉双黄酮(amentoflavone, AF)是从卷柏中提取的一种双黄酮类单体，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗癌等作用。Ras/Raf/促分裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase, MEK)/细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)信号通路是影响细胞增殖、分化、存活等过程的重要途径。在鼻咽癌中，Ras/Raf/MEK/ERK通路的异常激活可促进NPC细胞的增殖与转移[2]。本研究以鼻咽癌细胞株CNE-1为研究对象，探究AF对鼻咽癌细胞恶性生物学行为的影响及其具体机制。

1、材料与方法

1材料

细胞人鼻咽癌胞株CNE-1,购自中国科学院上海生命科学研究院。

药品与试剂穗花杉双黄酮，纯度：≥98%,批号：20160320,购自上海源叶生物科技有限公司；Ras激活剂RASAL1,规格：每支1 mg·mL-1,批号：20180911,购自英国Abcam公司。放射免疫沉淀(radio immunoprecipitation assay, RIPA)蛋白裂解液，购自美国Thermo Fisher公司；噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT)试剂盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白浓度测定试剂盒，均购自北京天根生物公司；膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)/碘化丙啶(propidium iodide, PI)细胞凋亡检测试剂盒，购自南京凯基生物有限公司；Ras、Raf、MEK、ERK1/2、磷酸化ERK1/2(phosphorylated- ERK1/2,p-ERK1/2)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)一抗及其相应二抗，均购自美国Santa Cruz公司。

仪器CytoFLEX流式细胞仪，美国Beckman公司产品；GDS-800 UVP凝胶成像系统，美国UVP公司产品。

2实验方法

2.1细胞培养

将CNE-1细胞接种在含10%胎牛血清的DMEM细胞培养基中，并放置在5%CO2的细胞培养箱中37℃下培养，培养基每2 d更换一次，当细胞生长至接近铺满瓶底时，进行传代，传代3次后取对数生长期细胞用于实验。

2.2细胞分组与处理[3,4]3-4]

将对数生长期的CNE-1细胞以每孔5×103个的密度接种于96孔板中，待细胞贴壁后随机分为对照组(常规培养)、低浓度AF组(AF-L组，50μmol·L-1 AF)、中浓度AF组(AF-M组，75μmol·L-1 AF)、高浓度AF组(AF-H组，125μmol·L-1 AF)和高浓度AF+Ras激活剂RASAL1组(AF-H+RASAL1组，125μmol·L-1 AF+2 ng·mL-1 RASAL1)。

2.3以MTT法检测细胞增殖活性[5]5]

CNE-1细胞分组处理后，置于细胞培养箱中分别继续孵育24、48、72 h,弃去上层培养基，每孔加入0.5%MTT溶液20μL和无血清培养基80μL,继续在细胞培养箱中培养4 h。之后弃去培养基，每孔中加入DMSO 150μL,在摇床上低速振荡10 min,使结晶溶解。用酶标仪检测各组细胞在490 nm下的光密度(optical density, OD490)值。

2.4以划痕愈合实验检测细胞迁移能力[6]6]

将2.2处理后的CNE-1细胞以每孔1×105个的密度接种在6孔板中。待细胞约融合至80%,用无菌200μL移液枪枪头在细胞单层画出一道划痕形成损伤，用PBS洗涤后继续培养48 h,用倒置显微镜观察0 h和48 h时细胞的迁移距离并拍照，用Image J软件进行分析计算细胞划痕愈合率。划痕愈合率=(0 h划痕宽-48 h划痕宽)/0 h划痕宽×100%。

2.5以Transwell实验检测细胞侵袭能力[7]7]

在Transwell小室的上室加入按说明书比例稀释的Matrigel基质胶，37℃下孵育过夜。CNE-1细胞分组处理后，重悬使其密度为1×105 cell·mL-1,并接种在Transwell上室中，并在下室中加入含10%胎牛血清的培养基作为趋化剂，在细胞培养箱中孵育1 d。用棉签擦去上室未侵入的细胞，加入4%多聚甲醛固定，用结晶紫染色。在倒置光学显微镜下观察并计数穿过膜的细胞。

2.6以流式细胞术检测细胞凋亡率[8]8]

将对数生长期的CNE-1细胞以每孔3×105个的密度接种于6孔板中，培养过夜后，分组处理。继续培养48 h后，胰蛋白酶消化收集细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤2次后加入结合缓冲液500μL重悬细胞，加入Annexin V-FITC和PI各5μL于室温下避光反应15 min。用流式细胞仪测定细胞凋亡率。

2.7以蛋白质印迹法检测细胞中Ras/Raf/MEK/ERK信号通路相关蛋白表达[9]9]

取对数生长期的CNE-1细胞按“2.2”处理。加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒对总蛋白浓度进行定量，加入Ras(1∶1 000)、Raf(1∶1 000)、MEK(1∶1 000)、p-ERK1/2(1∶1 000)、ERK1/2(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)一抗于4℃下孵育过夜。次日，洗膜后加入相应二抗(1∶5000)于室温摇床下孵育2 h,加入ECL试剂进行显影，以GAPDH蛋白作为内参。在凝胶成像仪下进行曝光，用Image Lab软件对目标蛋白的灰度值进行分析。

3统计学处理

用Graph Pad Prism 7.0软件进行统计分析。计量资料用x¯±s

表示，多组间比较若符合正态分布且方差齐采用单因素方差分析和LSD-t检验，方差不齐时，选择Dunnett-t检验；不服从正态分布采用秩和检验。

2、结果

1 AF对CNE-1细胞增殖活性的影响

对照组常规培养，AF-L组、AF-M组、AF-H组分别用50、75、100μmol·L-1 AF处理；AF-H+RASAL1组用125μmol·L-1 AF+2 ng·mL-1 RASAL1处理。

与对照组相比，AF-M组、AF-H组细胞OD490值(48 h、72 h)均显著下降(均P<0.05),AF-L组差异无统计学意义(P>0.05)。与AF-L组相比，AF-M组、AF-H组细胞OD490值(48 h、72 h)显著下降(P<0.05)。与AF-M组相比，AF-H组细胞OD490值(48 h、72 h)显著下降；与AF-H组相比，AF-H+RASAL1组细胞OD490值(48 h、72 h)显著上升(均P<0.05),见表1。

2 AF对CNE-1细胞迁移能力和侵袭能力的影响

与对照组相比，AF-M组、AF-H组细胞划痕愈合率和细胞侵袭数目显著下降(P<0.05),AF-L组差异无统计学意义(P>0.05)。与AF-L组相比，AF-M组、AF-H组细胞划痕愈合率和细胞侵袭数目显著下降(P<0.05)。与AF-M组相比，AF-H组细胞划痕愈合率和细胞侵袭数目显著下降(P<0.05)。与AF-H组相比，AF-H+RASAL1组细胞划痕愈合率和细胞侵袭数目显著上升(P<0.05),见表2。

3 AF对CNE-1细胞凋亡率的影响

与对照组相比，AF-M组、AF-H组细胞凋亡率显著上升(P<0.05),AF-L组差异无统计学意义(P>0.05)。与AF-L组相比，AF-M组、AF-H组细胞凋亡率显著上升(P<0.05)。与AF-M组相比，AF-H组细胞凋亡率显著上升(P<0.05)。与AF-H组相比，AF-H+RASAL1组细胞凋亡率显著下降(P<0.05)。结果见表2和图1。

表1各组CNE-1细胞增殖活性比较(x¯±s)

表2各组CNE-1细胞划痕愈合率、细胞侵袭数目和细胞凋亡率比较(x¯±s)

4 AF对CNE-1细胞中Ras/Raf/MEK/ERK信号通路相关蛋白表达的影响

与对照组相比，AF-M组、AF-H组细胞Ras、Raf、MEK蛋白表达水平、ERK1/2磷酸化水平显著下降(P<0.05),AF-L组差异无统计学意义(P>0.05)。与AF-L组相比，AF-M组、AF-H组细胞Ras、Raf、MEK蛋白表达水平、ERK1/2磷酸化水平显著下降(P<0.05)。与AF-M组相比，AF-H组细胞Ras、Raf、MEK蛋白表达水平、ERK1/2磷酸化水平显著下降(P<0.05)。与AF-H组相比，AF-H+RASAL1组细胞Ras、Raf、MEK蛋白表达水平、ERK1/2磷酸化水平显著上升(P<0.05),见表3和图2。

图1以流式细胞术检测CNE-1细胞凋亡情况

表3 CNE-1细胞中Ras/Raf/MEK/ERK信号通路相关蛋白表达的比较(x¯±s)

图2以蛋白质印迹法检测CNE-1细胞中Ras/Raf/MEK/ERK信号通路相关蛋白表达

3、讨论

AF为中药类的黄酮单体，具有多种生物活性。张金丽等[10]研究发现AF可以抑制卵巢癌细胞SKOV3的迁移和侵袭，其主要机制可能与上调细胞黏附因子E-cadherin/β-catenin复合体的表达有关。CAI等[11]研究发现AF能通过增加miR-16-5p的表达诱导Wnt/β-catenin途径失活，抑制结直肠癌组织中HMGA2的表达，以显著抑制结直肠癌细胞的迁移、侵袭和上皮间质转化过程。CHEN等[12]研究发现AF能够有效诱导非小细胞肺癌细胞的生长抑制、G1细胞周期阻滞、细胞凋亡和侵袭的抑制作用，其机制可能与下调NF-κB信号传导、基质金属蛋白酶-2、细胞周期蛋白D1、血管内皮生长因子的表达有关。本研究结果显示，与对照组相比，AF-M组、AF-H组CNE-1细胞OD490值(48 h、72 h)、细胞划痕愈合率、细胞侵袭数目均显著降低，细胞凋亡率显著升高。这说明AF能够抑制NPC细胞增殖、迁移和侵袭，促进其凋亡，从而影响NPC细胞的恶性生物学行为。

Ras/Raf/MEK/ERK信号通路是由小GTP结合蛋白连接活化的受体酪氨酸激酶和胞浆蛋白激酶的级联反应。当细胞受到外界病理信号的刺激后，激活Ras,激活型的Ras磷酸化激活Raf,进而激活MEK,MEK经磷酸化最终激活ERK,活化的ERK进入细胞核，启动相应的转录过程[13],该信号通路在癌症的发生发展中具有重要的调节作用。本研究结果显示，与对照组相比，AF-M组、AF-H组CNE-1细胞Ras、Raf、MEK蛋白表达水平、ERK1/2磷酸化水平显著下降。这说明AF可能通过下调Ras/Raf/MEK/ERK信号通路抑制NPC细胞增殖、迁移和侵袭，促进其凋亡。

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基金资助:山东省中医药科技基金资助项目(Z-2022003);

文章来源:杨西国,杨西霞,朱婷等.穗花杉双黄酮对鼻咽癌细胞恶性生物学行为的影响[J].中国临床药理学杂志,2023,39(21):3111-3115.