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骨髓间充质干细胞来源外泌体抑制高糖诱导的腹膜间皮细胞EMT

2024-07-31 47 上传者：管理员

摘要：目的探讨骨髓间充质干细胞外泌体(BMSCs-Exo)对高糖腹膜透析液(PDF)作用下人腹膜间皮细胞系(HMrSV5)发生上皮-间充质转化(EMT)的影响及其作用机制。方法采用透射电镜、纳米颗粒追踪分析仪和Western blot对BMSCs-Exo进行鉴定;将HMrSV5细胞进行分组:1)对照组; 2)不同浓度PDF(1.5%、2.5%、4.25%)组; 3) si NLRP3组; 4) si NC组; 5) BMSCs-Exo组。Western blot检测EMT标志物及NLRP3炎性体通路蛋白的表达，RT-qPCR检测mRNA表达，ELISA检测细胞上清中炎性因子表达量。结果 BMSCs-Exo呈双层膜结构的圆形囊泡，直径40～150 nm，外泌体特异标记物CD9、CD81、TSG101和Alix阳性;与对照组相比，PDF组细胞中α-SMA、vimentin、NLRP3、pro-caspase-1及pro-IL-1β表达明显上调，而E-cadherin表达下调(P <0.05); PDF组细胞上清中TGF-β1、IL-1β和IL-18表达量显著提高(P <0.05)。si NLRP3组细胞α-SMA表达下降，而E-cadherin表达明显上调。与4.25%PDF组比较，BMSCs-Exo组细胞E-cadherin表达上调，而vimentin、α-SMA、NLRP3、pro-caspase-1、pro-IL-1β蛋白表达下调(P<0.05); ELISA结果显示，BMSCs-Exo可下调4.25%PDF诱导的细胞上清IL-1β、IL-18、TGF-β1的水平(P<0.05)。结论高糖PDF通过激活NLRP3炎性体信号途径诱导腹膜间皮细胞EMT,BMSCs-Exo可通过抑制该通路改善腹膜间皮细胞EMT。

关键词：
NLRP3
上皮-间充质转化(EMT)
终末期肾病
腹膜间皮细胞
间充质干细胞外泌体
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腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)是治疗终末期肾病的一种有效替代治疗方式，但随着透析时间的延长，腹膜纤维化，腹膜超滤功能和转运功能下降，甚至衰竭即腹膜透析超滤失败，成为患者退出PD的主要因素[1]。大量研究表明，人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells,HP MCs)的上皮-间充质转化(epithelia-mesen-chymal transition,EMT)在P D相关性腹膜纤维化中起关键作用[2]。

NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 (NOD-like receptor thermal protein domain associated protein3,NLRP3)炎性小体激活，是启动重要促炎性细胞因子白细胞介素1β(interleukin1β,IL-1β)、IL-18成熟和释放的关键步骤，在炎性反应过程及多种非感染性疾病的发生发展中发挥重要作用[3-4]。有研究报道，NLRP3与腹膜纤维化的进展相关[5]。目前，以NLRP3作为抑制腹膜纤维化治疗靶点的药物也正在进行有益尝试，但具体机制仍待进一步研究。

有研究表明，间充质干细胞来源的外泌体(mesenchymal stem cells-derived exosomes,MSCs-Exo)作为多种疾病的治疗手段，具有促进损伤修复及抗纤维化作用[6-8]，可改善肾、肝及心肌纤维化[9-10]。但目前MSCs-Exo对腹膜纤维化的具体作用及机制尚不清楚。本实验旨在探讨骨髓间充质干细胞外泌体(bone marrow mesenchymal stem cellderived exosomes,BMSCs-Exo)对高糖腹膜透析液(peritoneal dialysis fluid,PDF)诱导HPMCs发生EMT及NLRP3信号途径的影响，为临床应用MSCsExo抑制腹膜纤维化提供新的科学依据。

1、材料与方法

1.1材料

人腹膜间皮细胞系HMr SV5(本课题组前期使用后保存[11]);HBMSCs (普诺赛公司);1.5%、2.5%、4.25%葡萄糖腹透液(广州百特公司);胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、DMEM/F12培养基(Gibco公司);IL-1β、IL-18、TGF-β1 ELISA试剂盒(Pepro Tech公司);RNA抽提用的Trizol试剂、反转录试剂盒和RT-q PCR试剂盒(Ta KaRa公司);兔抗人vimentin、E-cadherin、α-SMA、CD9、CD81、TSG101、Alix、Calnexin (Protein Tech Group公司);NLRP3siRNA (Dharmacon公司)，Lipofectamine 2000(Thermo公司);RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒(碧云天公司);PCR引物(上海生工)。

1.2方法

1.2.1 BMSCs-Exo提取与表征:

复苏BMSCs后，在专用培养基中，37℃、5%CO2条件下培养。第3代～第4代BMSCs，当细胞汇合80%时，重悬至106/m L。PBS清洗2次，换用无外泌体血清配制的α-MEM完全培养液培养细胞，传代后培养48 h后收集上清。收集到的上清在4℃，2 000×g条件下离心30 min，去除细胞及细胞碎片。通过超速离心提取BMSCs培养上清中的外泌体，PBS重悬后于-80℃保存，用于后续实验。利用BCA试剂盒测定外泌体总蛋白浓度。透射电镜观察外泌体形态，纳米粒子跟踪分析仪NTA和Zeta VIEW检测粒径及浓度。Western blot检测外泌体表面标志蛋白CD9、CD81、TSG101、Alix和阴性蛋白Calnexin。

1.2.2细胞培养、分组及处理:

HMr SV5常规培养传代，细胞接种于24孔培养板中。每孔加500μL DMEM/F12培养液，置于37℃、5%CO2条件的培养箱中，细胞增殖至80%汇合，换用0.5%FBS DMEM/F12培养液进行细胞同步24 h，根据不同处理措施分为以下5组:1)正常对照组:0.5%FBS DMEM/F12培养基;2)高糖PDF组:分别加不同浓度(1.5%、2.5%、4.25%) PDF作用48 h;3) si NLRP3组:细胞转染NLRP3 siRNA 24 h后用含添加4.25%PDF的完全培养基培养，作用48 h;4) si NC组:细胞转染NC siRNA后用含4.25%PDF的完全培养基培养;5) BMSCs-Exo组:细胞用含4.25%PDF的完全培养基与BMSCs-Exo(200μg/m L)共培养，作用48 h。收集各组细胞进行RNA和蛋白的提取，同时留取细胞培养上清液分别后续检测分析。

1.2.3 RT-q PCR检测mRNA水平:

各组细胞总RNA采用Trizol法提取，参照试剂盒说明书反转录合成c DNA。以反转录合成的c DNA为模板，GAPDH为内参，进行RT-q PCR检测，每组实验设有3个重复。反应体系20μL:c DNA (200 ng/μL)2μL、SYBRⓇPremix Ex TaqTM(2×) 10μL、正反向引物各0.4μL、dd H2O 7.2μL。反应条件:95℃预变性2 min,95℃变性15 s,60℃退火20 s,72℃延伸20 s，循环40次。以GAPDH为内参，用2-△△Ct分析数据。引物序列见表1。

1.2.4 Western blot检测蛋白质表达水平:

收集各组细胞，RIPA裂解液提取细胞总蛋白后进行BCA法蛋白定量，SDS-聚丙烯酰胺凝胶(12%)电泳，PVDF转膜。5%脱脂奶粉37℃封闭1.5 h，一抗(1∶1 000) 4℃孵育过夜。次日用PBST洗膜，二抗(1∶3 000)室温孵育2 h，用PBST漂洗后，ECL底物孵育、曝光、显影及结果分析。每组实验均做3次重复。应用计算机图像分析系统半定量分析vimentin、α-SMA、E-cadherin、NLRP3、pro-caspase-1、proIL-1β各条带吸光度度差异，以GAPDH吸光度作为内参，计算各目的蛋白相对表达量。

1.2.5细胞内源性NLRP3沉默:

采用si NLRP3对细胞内源性的NLRP3进行沉默，Scrambled siRNA(si NC)不降解任何已知的细胞mRNA，用作阴性对照。首先对si NLRP3的沉默效率进行检测，将细胞接种至6孔板中，每孔细胞数为1.0×105～1.2×105，分为2组:si NC组和si NLRP3组。待细胞贴壁后，使用Lipofectamine 2000进行siRNA的转染，转染时siRNA的终浓度为100 nmol/L。转染48 h后，提取细胞RNA和蛋白质，检测NLRP3 siRNA的沉默效果。为进一步验证细胞内源性的NLRP3沉默是否影响高糖PDF诱导HMr SV5细胞发生EMT，将细胞接种后，分为3组:对照组、si NC+4.25%PDF组、si NLRP3+4.25%PDF组，即细胞转染24 h后，在转染组中添加4.25%PDF继续培养48 h，检测E-cadherin和α-SMA蛋白质水平。

表1引物序列

1.2.6 ELISA检测细胞培养上清中IL-1β、IL-18、TGF-β1蛋白含量:

收集各组HMr SV5细胞培养液置于4℃，2 000×g条件下离心10 min后取上清，用于ELISA检测。具体操作参照试剂盒说明书进行，显色后，15 min内用酶标仪读取450 nm波长处吸光度(A)值，做标准曲线，根据样品A值换算出相应指标的实际浓度。

1.3统计学分析

使用Graphpad Prism 8软件进行统计分析。所得实验数据采用均数±标准差表示，两组间差异比较采用独立样本t检验，多组间差异采用ANOVA统计分析。P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1 BMSCs-Exo鉴定

外泌体表现为具有双层膜结构的圆形囊泡(图1A)，直径为40～150 nm，平均直径73.88 nm，浓度约1～2×1010个颗粒/m L(图1B)。外泌体特异性表达CD9、CD81、TSG101,Calnexin阴性(图1C)。

2.2高糖PDF对HMr SV5细胞EMT的影响

与对照组相比，高糖PDF诱导组，在mRNA水平(表2)和蛋白质水平(图2A)均出现上皮标志物E-cadherin表达下调，而间充质细胞标志物vimentin、α-SMA表达上调(P<0.05)。ELISA检测结果显示，细胞上清中TGF-β1表达量增加(P<0.05)(图2B)，且上述作用呈现浓度依赖性。

图1 BMSCs-Exo特征鉴定

表2高糖PDF对HMr SV5细胞中α-SMA、E-cadherin、TGF-β1及NLRP3 mRNA表达量的影响

2.3高糖PDF对NLRP3炎性体信号通路的影响

Western blot检测结果显示，与对照组相比，高糖PDF诱导组NLRP3、pro-caspase-1、pro-IL-1β表达上调(P<0.05)(图3A)。ELISA检测结果显示，高糖PDF可呈剂量依赖性地上调细胞上清中IL-1β、IL-18的水平(P<0.05)(图3B)。

图2高糖PDF对HMr SV5细胞EMT的影响

图3高糖PDF对NLRP3炎性体信号通路的影响

2.4沉默内源性NLRP3炎性小体对HMr SV5细胞EMT的影响

RT-q PCR检测结果显示，si NLRP3组与si NC组相比，NLRP3的mRNA水平下降约80%(图4A)，其蛋白质水平也出现明显降低(P<0.01)(图4B)，说明si NLRP3有较好的沉默效果，可以用于后续实验。

Western blot检测结果显示，与对照组相比，si NC+4.25%PDF处理组α-SMA表达明显上升，E-cadherin表达水平下降;但是si NLRP3+4.25%PDF处理组与si NC处理组相比，α-SMA水平有明显的降低、E-cadherin表达水平有明显上升(P<0.01)(图4C)。

2.5 BMSCs-Exo对高糖PDF诱导的HMr SV5细胞转分化EMT的影响

Western blot检测结果显示，与4.25%PDF组比较，BMSCs-Exo组细胞E-cadherin表达上调，而vimentin和α-SMA表达下调(P<0.01)(图5A)。NLRP3、pro-caspase-1、pro-IL-1β蛋白表达下调(P<0.01)(图5B)。ELISA检测结果显示，BMSCsExo可下调4.25%PDF诱导的细胞上清IL-1β、IL-18、TGF-β1的水平(P<0.01)(表3)。

3、讨论

传统腹透液中具有高浓度葡萄糖、高级糖基化终末产物，葡萄糖降解产物、高渗透压、低p H等非生物相容性因素。长期刺激腹膜，可引起PMCs损伤，发生转化，是导致腹膜纤维化的主要原因。PMCs-EMT被认为是PD相关腹膜纤维化发生和进展的关键始动环节[12]。因此，如果能够阐明其分子机制，早期干预，无疑对逆转腹膜纤维化具有重要的意义。

PD过程中PMCs受到各种感染与非感染因素的反复刺激，可导致NLRP3炎性小体激活，通过效应分子caspase-1，进而启动其下游信号，持续的产生强效促炎因子IL-1β、IL-18等效应分子，引起腹膜炎性反应和结构重塑[5]。本研究结果也显示高糖PDF可诱导PMCs-EMT的发生，且在此过程中激活了NLRP3炎性小体相关组分的表达，导致细胞上清中炎性因子水平亦显著提高，与上述报道及本课题组前期研究结果一致[5,11]。为了进一步说明NLRP3炎性小体激活在PMCs-EMT中的关键作用，本研究采用NLRP3 siRNA分子，内源性阻断NLRP3表达，结果显示细胞转染si NLRP3后，可部分抑制高糖PDF诱导的HMr SV5细胞EMT，进一步提示NLRP3炎性小体途径介导了PMCs-EMT过程。

图4内源性NLRP3沉默对HMr SV5细胞EMT的影响

图5 Western blot检测BMSCs-Exo对高糖诱导的HMr SV5细胞EMT的影响

表3 ELISA检测细胞上清IL-1β、IL-18、TGF-β1的表达

如何阻断NLRP3炎性小体的过度活化的相关研究较少，目前虽有一些针对NLRP3炎性小体活化通路的小分子药物研究，但仍未能取得满意效果。外泌体是细胞外囊泡常见类型之一，直径约40～100 nm，其内包裹蛋白质、mRNA、microRNAs、脂质等生物活性分子，主要发挥细胞间的信息交换和物质转移作用。已有动物研究证实MSCs-exosome可改善血管损伤和急、慢性肾损伤[10,13]，并能缓解肝纤维化[11]，减轻炎性反应、改善心肌纤维化[14]。但很少有MSCs-Exo研究针对腹膜纤维化。本研究通过体外实验，发现腹膜间皮细胞同时给予BMSCs-Exo共培养可部分阻断4.25%PDF诱导的PMCs-EMT，且NLRP3炎性小体通路相关分子及细胞上清中的炎性因子水平亦明显下降，进一步表明BMSCs-Exo可以通过阻断NLRP3炎性小体的活化部分抑制PDF诱导的PMCs-EMT。

综上所述，本实验证实NLRP3炎性小体通路参与了高糖PDF诱导的PMCs-EMT,BMSCs-Exo对PMCs-EMT确有一定的抑制作用，其机制可能部分与阻断NLRP3炎性小体活化，从而抑制炎性反应或抗腹膜结构重塑有关。本研究的发现为腹膜纤维化防治提供了新思路，然而MSCs-Exo成分复杂，其具体如何发挥腹膜保护作用需要进一步研究。

参考文献:

[4]高源,郑刚,齐靖,等.NLRP3炎性小体在心脏病发病中的作用研究进展[J].基础医学与临床,2023,43:1162-1166.

[8]陈莉莉,孙永红,雷晓燕,等.间充质干细胞外泌体治疗肺部疾病的研究进展[J].基础医学与临床,2023,43:192-195.

基金资助:上海市浦东新区科技发展基金(PKJ2021-Y34);

文章来源:赵俊丽,朱君君,詹秋楠,等.骨髓间充质干细胞来源外泌体抑制高糖诱导的腹膜间皮细胞EMT[J].基础医学与临床,2024,44(08):1149-1156.