功能性腹泻(FD)是临床中较为常见的胃肠类疾病。腹泻时粪便通常为持续或反复不成形，以稀便与水样便为主要特点[1,2]。目前认为FD病因主与胃肠动力、脑肠轴异常、肠胃激素紊乱、肠道感染及菌群失调等因素相关[3]。FD产生时由于中枢神经系统和肠道功能发生紊乱，继而造成肠黏膜损伤，加重腹泻[4]。现阶段，对于脑肠轴理论在肠道功能异常性疾病中所发挥的作用越来越受到关注。脑肠肽作为胃肠道调节的关键因子与肠道病症产生具有密切关系。其中5-羟色胺(HT)作为重要的神经递质不仅可在胃肠黏膜下平滑肌细胞、肌间丛、神经丛等均有所分布，还与胃肠分泌及运动密切相关，并可通过调节相关受体对胃肠道运动和分泌功能发挥作用。现阶段，FD在我国不仅具有较高发病率，还对患者正常工作和生活造成不良影响，需给予及时有效的治疗。与西医对症治疗相比，中医采用整体调节，在腹泻治疗中有明显优势[5]。中医学认为，腹泻综合征与肝郁、脾虚等密切相关。芳香化浊调气法是从既往临床研究经验中总结而来，由紫豆蔻、乌药、百合、茯苓、当归、砂仁、白芍、大腹皮、川芎、炒白术、白扁豆、鸡内金、藿香、木香等中草药组合而成，可通过醒脾运脾、调畅气机等方面进行干预治疗，使脾气健运，以达到泄泻自止的效果[6]。本文探讨芳香化浊调气法对FD大鼠P物质(SP)、脑肠肽及肠黏膜损伤的影响。

1、材料与方法

1.1实验大鼠

选取健康雄性SD大鼠50只，4月龄，平均体质量(150±20)g,由山东群英医学研究有限公司提供，生产许可证号：SCXK(鲁)2019-0008,饲养环境为温度20～25℃,湿度50%～60%,自然光且空气流通，自由饮食饮水。实验经由医院实验动物伦理委员会批准同意(审批号：2020-08)。

1.2药物、试剂与仪器

香化浊调气法(北京同仁堂);蒙脱石散(博福-益普生天津制药有限公司，批号：S0289);5-HT酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海沪震生物科技有限公司);羊抗兔二抗(江苏凯基生物科技发展有限公司，批号：KGAA35);兔抗鼠5-HT、血管活性肠肽(VIP)抗体(美国Abcm公司，批号：ab18009、ab8556);免疫组织化学试剂盒(武汉三鹰生物技术有限公司);ELISA试剂盒(上海将来实业股份有限公司，批号：08/2019);大鼠VIP检测试剂盒(上海沪震生物科技有限公司);FA1604S型电子天平(上海精密科学仪器有限公司);十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电脉(SDS-PAGE)仪、湿电转膜仪(美国Bio-Rad公司);苏木素-伊红(HE)染色剂(武汉赛维尔生物科技有限公司，货号：G1005);全自动生化分析仪(佛山市汇泉医疗器械有限公司，型号：HQ)。

1.3分组与模型建立

将50只大鼠随机分为健康组、模型(FD)组、西药(MTSS)组、中药低浓度组、中药高浓度组各10只。除健康组外，其余大鼠均依据文献[7,8]采用束缚+冷刺激+饮食失节的复合式建立FD模型，在每日9∶00～10∶00用绳将动物前肢捆绑于自制木板凳上，将冷冻冰棒放与大鼠腹部，观察体征及症状，并进行隔日喂食，15 d后，观察动物如产生疲乏蜷卧、嗜睡且毛发无光枯黄，并伴随出现大便稀软甚至溏薄等，收集动物24 h粪便并记录湿重，其中稀软溏薄、含水量增高为造模成功。

1.4给药方法

FD组使用芳香化浊调气法治疗，依据文献[9]取白扁豆12 g、紫豆蔻15 g、百合15 g、白芍15 g、鸡内金15 g、藿香12 g、大腹皮12 g、茯苓15 g、当归12 g、川芎9 g、砂仁9 g、炒白术9 g、乌药9 g、木香9 g,将药物加水煎制得到药液300 ml,根据《中药药理研究方法学》按照体表面积计算大鼠给药量，为每鼠1 ml/100 g,中药高浓度为3.6 g/ml,中药低浓度为2.4 g/ml(相当临床成人药量的3倍和2倍)。MTSS组采用蒙脱石散进行干预，给药前用2 ml蒸馏水溶解，灌胃量为0.81 kg/d;健康组与FD组均采用等量生理盐水灌胃处理，均1次/d,连续14 d。

1.5各组粪便含水量及性状检测

治疗后24 h收集各组大鼠粪便，称重记录湿粪质量，依据粪便性状(Bristol)评分，粪便烘烤后行质量称重。粪便含水量=(湿粪质量-干粪质量)/湿粪质量×100%。Bristol分级评分标准：1级：硬块状；2级：肠条状且表面不平；3级：肠条状且表面裂缝；4级：柔软肠状；5级：软团且边缘清晰；6级：边缘糊的绒状；7级：水样无固状物。依据1级计1分，2级计2分，评分低为腹泻缓解。

1.6 ELISA法检测血浆及结肠组织中SP

血浆SP检测：用10%戊巴比妥钠3 ml/kg腹腔麻醉，取腹主静脉血3 ml,加入含10%乙二胺四乙酸二钠30μl及抑肽酶1 000 kIU试管中混匀，低温离心15 min,转速3 000 r/min,分离血浆，取上清进行放射免疫实验，检测血浆SP含量。结肠组织SP检测：大鼠禁食12 h后，麻醉剖开腹腔，距离肛门8 cm以内取结肠，并沿肠系膜纵方向开口，生理盐水反复冲洗，滤纸吸干后冻存，测前取出组织于1 ml生理盐水内煮沸5 min,冷却后加1 mol/L冰醋酸0.5 ml匀浆，用1 mol/L NaOH中和，低温离心15 min, 3 000 r/min,保留上清液，用放射免疫分析法检测结肠组织上清液SP含量。

1.7 HE染色及肠黏膜损伤检测

另取结肠黏膜组织2 cm×2 cm,冲洗后，4%甲醛溶液固定-石蜡包埋-切片，常规HE染色后于光学显微镜观察拍照。用Image.Pro Plus5.0.2图像分析软件分析各组肠黏膜厚度、绒毛高度和隐窝深度等肠黏膜损伤情况。

1.8免疫组织化学法检测结肠组织中脑肠肽的5-HT、VIP表达

取大鼠2 cm结肠，0.9%氯化钠冲洗，4%多聚甲醛固定，脱水-浸蜡-包埋-石蜡切片脱蜡、水化，修复，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，5%牛血清白蛋白(BSA)孵育30 min,加一抗5-HT(1∶100)、VIP(1∶300),4℃孵育过夜，PBS洗3 min, 3 min/次，加辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗，孵育15 min, PBS洗3次，2 min/次，加免疫组织化学链霉亲和素-生物素复合物(SABC),孵育15 min, PBS洗5 min×3次，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。高倍镜下随机取3个视野拍照，阳性表达呈棕黄色，Image-Pro Plus5.1图像分析软件处理，计算吸光值。

1.9统计学分析

采用SPSS23.0软件进行方差分析、LSD-t检验。

2、结 果

2.1各组血浆、结肠组织SP含量

与健康组比较，FD组血浆、结肠组织SP含量明显升高(P<0.05);与FD组比较，MTSS组血浆、结肠组织SP含量明显降低(P<0.05);与MTSS组比较，中药高浓度组血浆、结肠组织SP含量明显降低(P<0.05);MTSS组与中药低浓度组差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

2.2各组肠黏膜损伤

与健康组比较，FD组黏膜厚度、绒毛高度、隐窝深度均明显降低(P<0.05);与FD组比较，MTSS组黏膜厚度、绒毛高度、隐窝深度明显升高(P<0.05);与MTSS组比较，中药高浓度组黏膜厚度、绒毛高度、隐窝深度明显升高(P<0.05);MTSS组与中药低浓度组以上指标差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

2.3各组粪便含水量

与健康组比较，FD组粪便含水量明显升高(P<0.05);与FD组比较，MTSS组粪便含水量明显降低(P<0.05);与MTSS组比较，中药高浓度组粪便含水量明显降低(P<0.05);MTSS组与中药低浓度组粪便含水量差异无统计学意义(P>0.05),见表1、图1。

与健康组比较：1)P<0.05;与FD组比较：2)P<0.05;与MTSS组比较：3)P<0.05;与中药低浓度组比较：4)P<0.05;表2同

表1各组粪便含水量、血浆和结肠组织中SP含量及肠黏膜损伤比较

图1各组粪便含水量

2.4 HE染色

健康组结肠组织绒毛排列整齐，上皮完整；FD组肠黏膜损伤、上皮脱落现象严重，回肠绒毛高度缩短，间距增宽、不连续伴有大量炎性细胞及水肿；MTSS组与中药低浓度组肠黏膜组织均有不同程度的好转，但仍存在水肿，充血及炎细胞浸润；中药高浓度组肠黏膜组织肠绒毛高度有所增加，绒毛刷状缘连续性有所恢复，杯状细胞明显增多，炎性浸润明显减少，见图2。

图2各组结肠组织(HE染色，×200)

2.5各组结肠组织中5-HT、VIP表达

与健康组比较，FD组结肠组织中5-HT、VIP明显升高(P<0.05);与FD组比较，MTSS组结肠组织中5-HT、VIP表达明显降低(P<0.05);与MTSS组比较，中药高浓度组结肠组织中5-HT、VIP表达明显降低(P<0.05);MTSS组与中药低浓度组以上指标差异无统计学意义(P>0.05),见图3、表2。

图3各组结肠组织中5-HT、VIP表达(免疫组织化学染色，×200)

表2各组结肠组织中5-HT、VIP表达

3、讨 论

FD在中医里属于“泄泻”范畴，其中脾病湿盛是发病的重要病机，而外邪、内伤致使脏腑虚衰为FD产生的关键病因[10,11]。FD虽不能导致器质性病变，但对患者正常工作和生活均可造成不利影响，需给予及时治疗。现阶段，临床对于FD的治疗常采用止泻剂、肠道运动抑制剂等常规药物治疗，但效果并不理想[12]。而本文中在给药干预后，结果表明，芳香化浊调气法可能对改善FD大鼠的腹泻状况及粪便形态具有一定积极疗效。腹泻产生多由肝风郁结至胃肠引起风入脾胃，导致肠道运化失调、湿气凝结。而湿为浊之源、浊为湿之甚，二者相互转化，积湿为浊，湿遇毒而浊化，浊毒互结。又因湿性重浊黏滞，久之则气机不畅，致使腹泻产生。芳香化浊调气法方中的中药茯苓可祛肿利水、渗湿健脾，紫豆蔻具有开胃消食、化湿消痞之效，伴木香调和，可起到祛湿熄风，健脾清热之效，从而改善FD时期粪便不成型状态。王启杨[13]在研究中发现，将豆蔻、茯苓等中药用于腹泻治疗不仅具有降低粪便含水量等脾虚型腹泻症状，同时也对缩短腹泻时长，改善消化道消化吸收功能等方面具有良好治疗效用。该结果与本文研究结果相类似。

脑肠轴是脑与胃肠道间的双相调和系统，可由神经、免疫、内分泌因子等多因素介导调节。位于胃肠道肌间神经丛和黏膜下神经丛的5-HT及其受体可使胃肠道平滑肌产生松弛，进而影响肠道功能[14]。VIP可显著扩张血管、降低血压的物质与腹泻、腹痛等病症相关。本文结果提示，5-HT、VIP异常升高可造成胃肠道环形肌过度松弛，肠动力异常，内脏敏感性增强等，最终引起肠道功能紊乱，芳香化浊调气法可能对改善FD时期胃肠动力及其高敏状态具有一定疗效。方中药材茯苓有利水消肿、健脾渗湿之效；紫豆蔻可开胃消食、化湿消痞；百合能清心安神、养阴润肺；鸡内金则有涩精止遗、消食健胃之效。谢燕东等[15]在研究中表示，中药茯苓有健脾、除湿、和胃之效，白术有利水、中气、健脾之效，两药均在修复肠黏膜屏障功能方面具有良好效用。本文推测芳香化浊调气法可能在诸药合奏的基础上改善肠黏膜分泌及肠黏膜功能，同时也调节了SP的异常分泌以达到治疗FD的目的。SP是最早发现的一种神经肽，作为肠道中的关键兴奋性神经递质对促进肠蠕动及调节肠道平滑肌收缩具有干预作用，其含量升高可使结肠黏液分泌增多，并使抑制性脑肠肽VIP在血清及组织中的含量升高，从而导致胃肠胃动力兴奋，出现腹泻现象。本研究结果提示，芳香化浊调气法可能是通过改善SP分泌异常来调节胃肠道运动功能。现代药理学研究表明，白芍具有镇痛消炎及抑癌等药理学作用，其成分白芍总甙能增强肠神经系统释放兴奋性神经递质SP,并调节结肠运动和延长结肠收缩[16]。推测芳香化浊调气法白芍等成分的药学作用可抑制FD中SP、VIP表达，抑制FD时期内脏的敏感性改善结肠功能。

FD产生时可导致肠黏膜屏障功能被破坏，肠黏膜血液循环产生障碍，使肠黏膜细胞营养和氧供应降低，肠道与机体内环境物质及肠道微生物、病毒、细菌等相互作用，引起肠黏膜发生脱落[17]。本文结果提示，芳香化浊调气法可能对改善肠黏膜损伤具有一定效用。现代药理学研究显示，白扁豆中的有效成分能改善机体免疫功能，起到解毒、止泻、止呕效果[18,19]。方中木香、白术可对肠道活动产生双向调节作用，而藿香有调肠止泻、芳香化浊之效[20];白扁豆可健脾利湿、止泻淡渗；鸡内金可调胃肠、促消化、强免疫；大腹皮具有利水消肿、行气宽中之效。方中药材联用在FD治疗中共奏保肝健脾、降湿止泻、标本兼治之效。芳香化浊调气法可通过改善肠腔及内环境功能，维持肠道正常免疫生化稳态。赵娜等[21]在大鼠肠屏障功能干预的研究中发现，采用中医药干预对改善肠道微生态多样性、保护肠生物屏障完整性及修复腹泻肠黏膜功能效果良好。推测芳香化浊调气法可能通过改善肠道微循环，阻止病原菌与肠黏膜接触，维持肠胃菌群平衡，并在修复消化道黏膜及增强其屏障防御的同时，提升肠黏膜组织对营养物质耐受性，促进消化道细胞恢复，一定程度上降低炎性反应对肠黏膜产生的破坏作用。

综上，芳香化浊调气法可改善FD大鼠的疾病状态，其机制可能与降低粪便含水量，抑制SP含量及5-HT、VIP表达及改善肠黏膜损伤等因素相关，但对于芳香化浊调气法的在调节腹泻疾病中的具体机制仍需进一步探究。

参考文献:

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2李元,马捷,李峰,等.功能性腹泻中医辨证标准的现代文献研究[J].中华中医药杂志,2019;34(3):977-80.

4武彩虹.枯草杆菌二联活菌胶囊(肠溶)马来酸曲美布汀联合治疗功能性腹泻的临床效果分析[J].基层医学论坛,2021;25(11):1515-7.

5赵浩斌,翟双庆.基于数据挖掘研究名老中医治疗腹泻组方的用药规律[J].世界中医药,2023;18(11):1601-8.

6蔡春江,李莉,田雪瑞,等.雷氏芳香化浊加味方治疗腹泻型肠激综合征60例疗效观察[J].湖南中医杂志,2017;33(11):15-7.

7王晓燕,李春雨,张亚楠.近十年胃肠功能紊乱大鼠模型复制的研究进展[J].世界中西医结合杂志,2019;14(10):1478-80.

基金资助:河北省中医药管理局中医药类科研计划项目(2018029);河北省中医药管理局科研计划项目(2020156);

文章来源:刘宁,张洁,裴晓川,等.香化浊调气法对功能性腹泻大鼠P物质､脑肠肽及肠黏膜损伤的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(17):4214-4218.