溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,UC)是一种结直肠慢性非特异性炎症性疾病,病因尚不明确,其病变部位多在乙状结肠和直肠,也可延伸至降结肠,甚至整个结肠,组织损伤可累及大肠黏膜层和黏膜下层[1]。该病病程较长,常反复发作,治愈难度大。目前西医治疗UC的主要药物有5-氨基水杨酸、皮质类固醇、免疫抑制剂、生物制剂等,疗效确切,但随着服药时间的延长,不良反应逐日凸显[2]。中医药治疗UC具有突出优势,可缓解病情、预防复发。既往研究[3,4]表明,中药和针灸等中医药治疗有助于缓解UC症状,疗效可靠,不良反应少,复发率低。胃肠安丸是一种广泛应用于消化系统疾病的中药制剂,可有效缓解UC大鼠腹泻、便血等肠道症状,并且能修复肠道黏膜损伤,促进溃疡愈合[5,6],但其作用机制是否与免疫相关尚不清楚。因此,本研究通过建立UC小鼠模型,从免疫平衡方面研究胃肠安丸治疗UC的作用机制。

1、材料

1.1实验动物

SPF级C57BL/6小鼠60只,雄性,8周龄,体质量(20±2)g,购于北京斯贝福生物技术有限公司,动物许可证号SCXK(京)2015-0015。将小鼠饲养于中国中医科学院针灸研究所SPF级动物房,于通风隔音饲养笼饲养,予实验动物配方饲料(北京华阜康生物科技股份有限公司)喂养,自由进食、饮水。12h光照和黑暗循环,室温(24±2)℃,空气相对湿度35%～45%。

1.2实验药物

葡聚糖硫酸钠(DSS,43kDa,批号160110,美国MPBiomedicals公司)。胃肠安丸由天津中信医药集团有限公司乐仁堂制药厂提供(国药准字Z10880010),将胃肠安丸碾成粉末,储存备用,每次用精密天平称取0.06g胃肠安丸粉末溶于25mL热水(80～90℃)中,即为高剂量胃肠安丸溶液,取5mL高剂量溶液等比稀释,得到中剂量溶液,取5mL高剂量溶液4倍稀释,得到低剂量溶液,每天配制新鲜胃肠安丸溶液。美沙拉嗪肠溶片(0.5g/片,LosanPharmmaGmbH,进口药品注册证号H20171358),每天取1片,将外部黄色包衣轻轻刮去,溶于50mL热水中,充分溶解,配制成美沙拉嗪混悬液,4℃保存备用。

1.3实验试剂

抗体:PERatAnti-mouseCD4、BV421RatAnti-mouseCD25、PerCP-Cy5.5HamsterAnti-mouseCD3e均为BDPharmingen公司产品,批号分别为553653、566228、551163;APCanti-mouseIL-17A、BrilliantViolet510anti-mouseCD8a、AlexaFlour488anti-mouse/rat/humanFOXP3均为Biolegend公司产品,批号分别为506916、100752、320012)。CellActivationCocktail(withBrefeldinA)。IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、CRPELISA检测试剂盒96T,均为Erwantech公司产品,型号分别为ER14011、ER14025、ER14032、ER15112、ER17002。

2、方法

2.1动物造模与分组

参照文献[7]中的造模方法进行模型制备。将60只C57BL/6小鼠适应性喂养1周,除正常对照组(10只)外,其余小鼠均给予2.5%DSS水溶液自由饮用7d。造模结束后,根据疾病活动指数(diseaseactivityindex,DAI)评分进行模型评价,剔除DAI评分<1分的小鼠[8],50只小鼠均造模成功。将造模成功的50只小鼠随机分为模型组,胃肠安丸高、中、低剂量组,美沙拉嗪组,每组10只。

2.2给药方法

参照《中药药理研究方法学》[9],根据实验动物和人体表面积折算系数计算小鼠给药剂量,从造模结束当天(第1天)开始,胃肠安丸低、中、高剂量组分别给予0.015、0.03、0.06g/(kg·d)胃肠安丸混悬液0.5mL灌胃。1次/d,美沙拉嗪组给予0.52g/(kg·d)美沙拉嗪混悬液0.5mL灌胃,1次/d。正常对照组和模型组给予等体积纯水灌胃。均连续10d,给药期间自由饮食饮水。

2.3观察指标与方法

2.3.1DAI:

每天称量小鼠体质量,观察大便性状,检测粪便隐血情况,参考文献[8]根据动物体质量下降百分比、大便性状及隐血情况分别记分,计算各组小鼠DAI评分,DAI评分=(体质量下降分数+大便性状分数+便血分数)/3。

2.3.2小鼠结肠组织形态学观察:

药物干预结束,使用10%水合氯醛麻醉处死小鼠,分离小鼠结肠,测量结肠长度,然后取结肠远端约1cm长度,用10%中性甲醛固定后,石蜡包埋,切片,HE染色,光镜下观察切片组织学变化。

2.3.3脾组织中T淋巴细胞百分比检测:

采用流式细胞术检测。①脾脏单细胞悬液制备:用预冷的RPMI-1640培养基清洗脾脏,用无菌剪刀将脾脏剪成小块后,转移至70μm孔径的Falcon细胞筛网上,再取RPMI-1640培养基将细胞冲下,收集细胞悬液,以500g离心5min,弃上清。再加红细胞裂解液5mL,涡旋30s,在冰上孵育4～5min,偶尔摇晃,用PBS稀释裂解缓冲液,停止反应,以500g离心5min,弃上清。加无菌PBS5mL重悬,离心,弃上清。用适当MACS缓冲液重悬,制成单细胞悬液。将细胞悬液通过40μm孔径的Falcon细胞筛网,去除细胞团块,收集细胞悬液。取细胞悬液10μL用于细胞计数。②流式染色:将细胞悬液(2×106细胞)200μL转移至圆底流式管中。细胞表面标记染色:向样本管加入相应体积的抗体(CD3、CD8、CD25抗体,用量均为5μL/test),4℃避光孵育30min。加入StainingBuffer1mL,500g离心5min,洗涤细胞,离心后弃上清。细胞固定、破膜:重悬细胞,每管加入1mL新鲜配制的1×TranscriptionFactor、1×Fixsolution,涡旋混匀,室温避光孵育50min。每管加入2mL1×TranscriptionFactor、1×PermBuffer到固定的细胞中,4℃500g离心5min,弃上清。胞内及核内染色:每管加入100μL1×TranscriptionFactor、1×PermBuffer,同时加入IL-17及FOXP3抗体(5μL/test)后,涡旋混匀,4℃避光孵育50min。涡旋细胞:每管加入2mL1×TranscriptionFactor、1×PermBuffer,4℃,500g离心5min,弃上清。每管加入PBS洗液500μL,上机检测即可。

2.3.4血清细胞因子检测:

于药物干预结束次日,腹腔注射10%水合氯醛,麻醉后摘眼球取血于2mL促凝管中,2h内4℃3000r离心10min,分离血清,按ELISA试剂盒说明书操作。

2.4统计学方法

采用SPSS20.0统计软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,对满足正态分布和方差齐性的数值资料,采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1各组小鼠一般情况比较

适应性喂养期间,各组小鼠状态正常、活泼好动、毛色黑亮。造模期间无小鼠死亡,模型小鼠均能观察到肛周血渍,活动迟缓,喜蜷缩呈弓背状。干预期间小鼠死亡5只,其中美沙拉嗪组死亡1只,胃肠安丸高剂量组死亡1只,中剂量组死亡3只。

3.2各组小鼠体质量变化比较

造模第5天各组模型小鼠体质量开始下降,造模结束,体质量低于正常对照组(P<0.05)。干预第3天开始,各组小鼠体质量逐日增加。干预结束时,胃肠安丸高剂量组和美沙拉嗪组小鼠体质量高于模型组(P<0.05)。实验第10～16天为小鼠体质量增长阶段,计算此阶段小鼠体质量日均增长率,发现胃肠安丸高、中剂量组和美沙拉嗪组小鼠体质量日均增长率高于模型组。见封三图1,图2。

图2实验第10～16天各组小鼠体质量日均增长率

3.3各组小鼠DAI评分比较

从造模第3天开始,模型小鼠的DAI评分逐日增加,药物干预第2天达到高峰,之后各组小鼠DAI评分逐日下降,干预结束胃肠安丸中、高剂量组和美沙拉嗪组小鼠的DAI评分低于模型组(P<0.05)。实验第8～16天为DAI评分下降阶段,计算各组此阶段的DAI评分日均下降分数,发现胃肠安丸高、中、低剂量组和美沙拉嗪组小鼠DAI评分下降速度均快于模型组。见封三图3,图4。

图4实验第8～16天各组小鼠DAI日均下降分数

3.4各组小鼠结肠长度比较

药物干预结束后,各组小鼠结肠长度差异有统计学意义(F=8.386,P=0),模型组小鼠结肠长度短于正常对照组(P<0.05),其余给药组结肠长度有不同程度恢复,其中胃肠安丸低、高剂量组和美沙拉嗪组小鼠的结肠长度长于模型组(P<0.05)。胃肠安丸中剂量组虽长于模型组,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1各组小鼠结肠长度比较(cm,x¯±s)

3.5各组小鼠结肠组织HE染色结果

正常对照组小鼠肠黏膜上皮完整,上皮细胞连接紧密,固有层可见隐窝结构完整,排列有序,杯状细胞分泌旺盛,黏膜下层未见明显病变。模型组小鼠肠黏膜上皮缺损,上皮细胞连接疏松,隐窝结构破坏,排列紊乱,杯状细胞明显减少,间质层可见大量淋巴细胞、中性粒细胞等炎性细胞浸润,黏膜下层不同程度充血、水肿。胃肠安丸高剂量组、美沙拉嗪组小鼠结肠组织病理形态明显改善,黏膜缺损情况较模型组明显修复,上皮细胞连接较紧密,杯状细胞分泌增多,极少隐窝破坏,炎性细胞浸润不同程度降低;胃肠安丸中剂量组小鼠部分结肠组织黏膜中断,缺损面积小,少量隐窝破坏,黏膜下层可见少量炎性细胞浸润、水肿;胃肠安丸低剂量组仍见多处结肠组织黏膜中断,隐窝破坏,间质出现充血、水肿,炎性细胞浸润。见封三图5。

3.6各组小鼠脾组织中T淋巴细胞百分比比较

与正常对照组比较,模型组和各给药组小鼠脾组织中CD4+、CD8+、Treg细胞百分比降低(P<0.05)。各给药组脾组织中CD4+、CD8+、Treg细胞百分比较模型组升高,其中美沙拉嗪和胃肠安丸高剂量组与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组比较,模型组和各给药组脾组织中Th17细胞百分比升高,各给药组脾组织中Th17细胞百分比较模型组降低,其中美沙拉嗪和胃肠安丸高剂量组与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2各组小鼠脾组织中T淋巴细胞百分比比较(%,x±s)

3.7各组小鼠血清细胞因子水平比较

干预结束后,与正常对照组比较,模型组和各给药组小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-8、CRP水平升高(P<0.05),各给药组小鼠以上指标均较模型组降低(P<0.05)。干预结束后,与正常对照组比较,模型组、中剂量组、低剂量组IL-10水平降低(P<0.05),美沙拉嗪组、高剂量组IL-10水平升高(P<0.05);美沙拉嗪组、高剂量组、中剂量组IL-10水平与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3各组小鼠血清细胞因子水平比较(x±s)

4、讨论

UC在中医学中尚无明确病名,根据其腹痛、腹泻、黏液脓血便、里急后重的临床表现,归属于中医学“休息痢”“肠澼”“大瘕泄”“久泻”“久痢”等病证范畴。本病病位在肠,脾虚乃发病之根,且与肝、肾、胃等脏器密切相关,滞、郁、瘀为主要病理因素。泄痢之证皆因于湿,湿不化脾之过也。脾之所伤可因饮食积滞伤脾,亦可因肝气郁滞伤脾,脾为邪伤,健运失职,水湿不归正化,阻滞肠间,湿邪久滞不祛郁而化热,弥散入血而为毒,湿、热、毒滞留肠腑,损伤肠腑脂膜和血络而见下痢赤白脓血。故治当以清热化湿为主,可配合健脾、行气、导滞等法。

胃肠安丸由木香、沉香、枳壳(麸炒)、檀香、朱砂、大黄、厚朴(姜炙)、人工麝香、巴豆霜、大枣(去核)、川芎等11味中药组成。方中木香行气止痛、疏肝解郁、健脾导滞,厚朴行气止痛、燥湿除满消滞,两药合用共奏理气健脾、消滞止痛之功,共为君药。檀香、沉香、枳壳三药合用以行气调中止痛,共为臣药。朱砂能清心安神、逐中焦痰涎,川芎、麝香祛瘀通络止痛,大黄、巴豆霜二者相伍以攻积导滞,大枣健脾和中,共为佐使。诸药合用共奏化浊祛湿、理气止痛、健脾导滞的功效。研究[10]表明,胃肠安丸具有降低肠黏膜通透性,稳定肠黏膜屏障,防止细菌移位、内毒素扩散的作用,有抗病原微生物和止泻的功效。本研究采用2.5%DSS水溶液诱导UC小鼠模型,模型复制成功后进行药物干预。在药物干预过程中发现,各组小鼠体质量逐日增加,DAI评分逐日下降,其中胃肠安丸高剂量组小鼠体质量和DAI评分变化更为明显。药物干预结束,胃肠安丸组小鼠结肠长度、组织病理形态均优于模型组,胃肠安丸高剂量组效果更明显。可见胃肠安丸有助于改善UC小鼠腹泻、便血、体质量下降等一般情况,促进结肠形态恢复。

UC是一种由免疫介导的慢性非特异性肠炎,T淋巴细胞是免疫系统的主要成员,根据其细胞表面分化抗原(CD)可分为CD4+、CD8+两大类,二者在体内的细胞百分比直接反映人体的免疫水平[11]。在不同条件下,CD4+细胞又可分化为Th17和Treg细胞,前者及其相关细胞因子与许多炎症反应和自身免疫性疾病的发生和发展有关,后者具有免疫抑制调节功能,二者在分化过程中相互制约,在功能上相互抑制,共同维持机体自身免疫平衡[12]。IL-6、IL-8是促炎细胞因子,CRP是机体受到微生物入侵或组织损伤等炎症性刺激时肝细胞合成的急性相蛋白。IL-6是CRP合成的主要刺激因子[13],且能促进Th17细胞分化和激活急性期反应;而Th17分泌的IL-17能通过招募和激活中性粒细胞进而诱导成纤维细胞、血管内皮细胞等表达IL-6等促炎因子,二者形成正反馈环,协同促进炎症反应[14]。Treg细胞能分泌细胞因子IL-10,在炎症性肠病的发病过程中起至关重要的作用[15]。研究[16]表明,TNF、IL-6诱发的炎症反应在很大程度上是通过诱导产生以IL-8为代表的趋化因子所介导的。本研究发现,药物干预后,模型组小鼠脾组织中CD4+、CD8+、Treg淋巴细胞数量低于正常对照组,各给药组较模型组呈现不同程度上调,同时伴随CD4+、CD8+、Treg淋巴细胞数量上调的细胞因子为IL-10。上述指标的升高趋势与症状恢复一致。模型组小鼠Th17细胞百分比明显高于正常对照组,各给药组经过治疗呈现不同程度下降,伴随Th17下降的指标包括TNF-α、IL-6、IL-8和CRP。说明在干预过程中胃肠安丸促进UC模型小鼠体内CD4+、CD8+细胞百分比增加,一定程度上提高了细胞免疫功能,同时恢复了UC小鼠Treg/Th17免疫平衡;而促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8和抑炎因子IL-10之间的动态变化可能是促使上述T细胞百分比发生变化的关键。CRP的变化反映了炎症的时相,胃肠安丸各给药组的血清CRP水平均低于模型组,提示胃肠安丸能在一定程度上减轻UC小鼠的炎症状态。

综上所述,胃肠安丸对UC模型小鼠的治疗作用机制,可能与恢复Treg/Th17免疫平衡,调节相关细胞因子,提高小鼠机体免疫能力,恢复肠道生理稳定性有关。但中药复方治疗UC的机制复杂,因此胃肠安丸治疗UC的其他机制有待进一步深入研究。

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